Analysis of mRNA Transcriptional Levels from Artificially Infected Litopenaeus vannamei by White Spot Syndrome Virus (WSSV)

Abstract

WSSV (White Spot Syndrome Virus)는 새우 및 갑각류에서 높은 치사율을 일으키는 봉입체의 원형 바이러스로 국내외 새우 양식장에서 막대한 경제적 손실을 일으키고 있으나 이를 완벽하게 제어할 수 있는 방법이 아직 보고되어 있지 않은 실정이다. 현재까지 WSSV의 ORF (open reading frame)는 약 530여 개가 밝혀져 있으며 구조단백질은 약 40종이 알려져 있다. 가장 잘 알려진 구조단백질에는 envelop단백질인 VP19, VP28, VP51A, VP466, VP281과 nucleocapsid단백질인 VP24, VP26, VP15 등이 있다. 각각의 구조단백질들의 기능과 발현시기 및 WSSV의 감염 기작에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 건강한 새우에게 WSSV를 인위감염 시킨 후 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) 기술을 이용하여 다양한 감염시기에 따른 mRNA의 transcriptional level을 확인하여 바이러스의 분자생물학적 감염 기작을 분석하고자 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 새우는 6-8g의 Litopenaeus vannamei이며 in vivo titration 실험을 수행하여 이후 공격실험에 적용할 바이러스의 적절한 농도를 결정하였다. Titration 실험에서 virus stock을 200배 희석하여 새우에게 주사하였을 때 감염 후 10일이 경과되었을 때 90%의 폐사율을 보였으므로 이 농도를 공격실험에 사용하였다. 재조합 단백질에 대한 vaccination 실험으로 재조합 단백질 rVP19와 rVP28을 각각 상업용 새우사료와 섞어서 건조 시킨 후 14일 동안 섭이시킨 후 29G syringe를 이용하여 공격실험을 수행하였다. 그 결과 positive control은 11일째 100%의 폐사율을 보였고 rVP19와 rVP28 그룹은 감염 후 21일째 각각 66.7%와 41.7%의 누적폐사율을 보였다. Titration과 vaccination 실험수행 시 WSSV 감염되어 죽어가는 새우를 무작위로 채취하여 위상피, 심장, 장, 간췌장으로 장기분리 후 -80 ℃에 보관하였다. 보관된 새우장기 시료들로부터 total RNA를 분리한 후 이로부터 cDNA를 합성하고 얻어진 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. Titration 실험의 시료를 RT-PCR을 이용하여 분석하여 본 결과 다른 단백질들에 비하여 주요한 envelop단백질인 VP19와 VP28이 가장 먼저 확인되었으며 그 다음으로 VP26이 확인된 이후 VP51A, VP15, VP24가 확인되었다. 이러한 단백질의 transcription pattern은 rVP19와 rVP28을 이용한 vaccination 실험을 한 시료의 경우에도 동일하게 나타났으나 VP26, VP51A, VP15, VP24의 경우 vaccination 을 하지 않은 경우와 비교하여 4일에서 10일 정도 늦게 단백질이 확인되었다. 이는 재조합 단백질이 새우의 면역시스템을 활성화 시켜 VP19와 VP28의 transmembrane domain으로의 기능을 저해하여WSSV의 life cycle에서 바이러스가 호스트세포 내로 들어가는 과정을 막기 때문에 vaccination을 한 경우 단백질들이 더 늦게 나타나는 것을 확인하였다. 공격실험 후 얻어진 누적폐사율그래프로 RT-PCR을 이용한 분석을 통해 보았을 때 rVP19보다 rVP28이 단백질백신으로써 더 효율적임을 확인할 수 있었다. 본 실험으로 새우의 면역 시스템이 WSSV의 구조단백질과 같은 항원을 인식할 수 있음을 확인하였고 WSSV에 대한 사료 급이에 의한 백신처리가 가능함을 확인하였다.