Mass Production of Recombinant Ghost Vaccine against Streptococcal Disease in Olive flounder, Paralichthys olivaceus

Abstract

본 연구에서는 연쇄구균증의 원인종인 Streptococcus iniae로부터 단백질 백신 개발을 위한 유전자로 enolase, GAPDH, sagA 및 piaA를 target antigen으로 선택하였고, 이와 함께 항원의 표면 발현을 위한 InaN 신호 서열과 고스트 생성을 위한 Ghost 37 SDM cassette가 포함된 재조합 플라스미드를 E. coli DH5α에 cloning 하였다. Cloning된 재조합 플라스미드 pHCE-InaN-antigens-ghost 37 SDM을 5 L 발효기를 이용하여 고스트 백신의 산업화를 위해 탄소원 공급조건, 교반속도, 산소공급 조건 등의 최적 배양조건을 검토하였고, 고스트 발현 유도를 위한 온도조절 시점과 그에 따른 발현효율 최적화에 관한 연구를 수행하였다. 각각 다른 4종의 항원 후보 유전자를 보유한 재조합 E. coli DH5α 고스트를 LB 배지를 이용하여 배양한 결과 모두 1 g/l glucose, 300 rpm, 1 vvm에서 최대 균주 성장을 나타내었다. 고스트 생성 효율의 경우 초기 대수증식기 (OD_(600)=1.0) 고스트 발현을 유도했을 때 각각 최대효율인 99.9%를 나타내었으나 균주 성장이 증가할수록 낮은 생산성을 보였다. 따라서 본 연구에서는 고스트 생산성의 개선을 위한 방안으로 host를 E. coli XL1-Blue로 형질전환하여 새로운 고스트 백신 생산균주인 E. coli XL1-Blue/pHCE-InaN-GAPDH-Ghost 37 SDM 을 제작하였으며, 산업화를 위한 대량생산 배지로서 Riesenberg 배지를 기본으로 하여 배지 조성을 최적화하였다. 그 결과 Riesenberg 배지에 20 g/l의 glucose, 10 g/l의 yeast extract 및 250 mg/l의 thiamine을 첨가하여 사용하는 것을 최적조건으로 결정하였다. 최적화된 배지를 사용하여 유가식 배양을 통해 고스트 백신 생산량을 증가 시킬 수 있는 nutrient feeding strategy와 high temperature holding range를 추가 적용함으로써 고스트 시스템의 발현은 높은 수준으로 유지 되면서 고스트 백신의 생산은 증가시킬 수 있는 조건을 검토하였다. 시간별로 고스트 생성 효율을 확인한 결과 특히 47oC에서 2 시간 동안 온도를 유지하는 것이 배양공정 면에서 가장 효과적으로 live cell의 수를 감소시키는 것으로 판단되었으며, 고스트 백신생산량은 22 g dcw/l를 나타내었다. 국내 양식 어류종인 넙치를 대상으로 S. iniae 백신에 대한 효능을 검증하고자 challenge test를 실시하였다. 그 결과 고스트 백신 그룹 (42℃) & (47℃)과 FKC control 그룹이 pre-immune, PBS, E. coli host strain 등의 다른 control 그룹 보다 항체역가가 더 높게 나타났으며 특히 고스트 백신 (42℃) 의 항체역가가 가장 높은 것으로 확인되었다. 일자별로 누적 폐사량을 관찰한 결과 2 주일 경과 후 최종 누적 폐사율은 positive control 과 E. coli XL1-Blue host strain control이 각각 100%의 폐사율을 나타내었으며, formalin-killed cell (FKC) vaccine은 66%의 폐사율을 나타내었고 고스트 백신을 처리한 그룹은 42%의 폐사율을 나타내었다. 백신 효능 검증 결과 본 연구를 통해 대량 생산된 고스트 백신이 formalin-killed cell (FKC) vaccine보다 면역 효과가 크다는 것을 확인 할 수 있었고, 이는 E. coli 를 이용한 고스트 백신이 양식 산업에 있어 효과적이면서도 상업적으로 유용한 백신으로 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.