Molecular cloning, expression analysis and enzymatic characterization of cathepsin K from olive flounder (Paralichthys olivaceus)

Abstract

Papain family중 하나인 cysteine proteases는 근골격계 질환 치료를 위한 target molecule로 인식되어 왔고, 그 중 세포 외 기질 단백질인 collagen을 분해할 수 있는 cathepsin S와 K에 많은 연구가 집중되고 있다. 파골 세포에서 발현되는 cathepsin K는 골 흡수 억제제 개발을 위한 주요 타겟으로써 연구가 진행되고 있다. 이 연구에서는 넙치 cathepsin K 유전자의 발현 양상과 넙치 cathepsin K(PoCtK)의 클로닝, 발현 및 효소특성을 분석하였다. 넙치의 cathepsin K 유전자를 정상조직과 LPS 자극을 한 조직에서의 발현 양상을 분석한 결과 근육에 LPS를 자극 후 6시간째에 발현량이 눈에 띄게 증가하였다. Cathepsin K 유전자를 클로닝 및 서열화 하였으며, 재조합 단백질을 발현시켜 그 특성을 분석하였다. 재조합 된 cathepsin K 단백질은 pGEX-4T-1 벡터를 사용하여 E. Coli DH5αMCR 균주에서 발현되었으며, soluble한 cathepsin K는 GST fusion protein으로 50kDa으로 정제되었으며, 이 단백질은 gelatin 분해능을 보였으며, chondroitin 4-sulfate와 complex를 이루어 collagen type Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅵ와 넙치 근육으로부터 분리한 acid soluble collagen을 분해하였다. 최적 pH인 8.0에서 Synthetic Fluorogenic Substrate인 Z-GPR-AMC을 분해함을 이용하여 저해제와 보조인자 효과를 알아본 결과, 일반적으로 알려진 E-64에는 농도의존적으로 저해되었고, Antipain과 leupeptin에 거의 완벽하게 저해되었다. 보조인자 시험에서는 칼슘이온의 효과가 가장 컸다. 이 결과들로부터 PoCtK는 포유류의 cathepsin K와 기능적으로 유사함을 알 수 있었고, 이를 이용하여 어류의 근육 염증 및 궤양, 뼈 변형 등의 질병 연구에 중요한 정보를 제공할 것으로 생각된다.

In this study, we assessed the putative physiological roles of cathepsin K from the muscles of a flatfish, the olive flounder. This is the first report addressing enzymatic characterization in fish. In this study, we have cloned a cDNA encoding for cathepsin K (PoCtK), a cysteine protease of the papain family from the olive flounder, Paralichthys olivaceus. The tissue-specific expression pattern of PoCtK, determined via RT-PCR analysis, revealed ubiquitous expression in normal and bacterial lipopolysaccharide (LPS)-stimulated tissues with high levels of expression in the heart, kidney, spleen, gill, and bone marrow. However, IL-1β and PoCtK expressions were shown to be significantly increased in muscle only at 6h post-injection with LPS. The cDNA encoding for the mature enzyme of PoCtK was expressed in Escherichia coli using the pGEX-4T-1 expression vector system. Its activity was quantified via the cleavage of the synthetic peptide Z-Gly-Pro-Arg-AMC, zymography, and the collagen degradation assay. The optimum pH for the protease activity was 8, and the recombinant PoCtK enzyme degraded collagen types I, II, III, IV, and VI and acid-soluble collagen from olive flounder muscle in the presence of chondroitin 4-sulphate (C-4S).