Mutational Analysis and Characterization of Catechol 2,3-Dioxygenase from 3,4-Dichloroaniline Degrading Bacterium Pseudomonas sp. KB35B

Abstract

염화아닐린계(chloroanilines) 화합물들은 오랜 기간 동안 페인트, 농약, 플라스틱, 제약회사 등의 중요한 intermediates로 사용된다. 이 화합물은 분자 내에 염소원자를 가지고 있기 때문에 토양 미생물의 분해에 대한 저항성을 가지며, 토양 부식물질과의 화학적인 결합으로 토양 내에 장시간 잔류하므로 심각한 환경 오염물질로 문제시 되고 있다. 이전 선행연구에서 유기독성 물질로 환경 중에 잔류하여 토양 및 수질 오염을 유발하는 3,4-DCA를 효과적으로 분해 할 수 있는 미생물인 Pseudomonas sp. KB35B 균주를 분리하였다. KB35B균은 특이적으로 catechol 2,3-dioxygenase (CD-2,3)의 활성이 3,4-dichloroanilines의 존재 하에 크게 증가한 것으로 나타나 선행연구에서는 CD-2,3이 3,4-DCA 분해에 관여하는 중요한 효소군 중 하나로 추측하였다. 따라서 본 연구에서는 3,4-DCA를 효과적으로 분해하는 KB35B 균주의 분해반응 기구를 효소학적 측면에서 조사하기 위해 CD-2,3 유전자를 클로닝하였다. 클로닝 한 염기서열을 분석한 결과 Pseudomonas putida G7과 4개의 아미노산 (Q116, N142, V215, H250)만 다른 것으로 나타나 이 4개의 아미노산이 효소의 활성에 어떤 중요한 역할을 하는지를 알아보기 위해 이 아미노산들을 유사성이 가장 높은 Pseudomonas putida G7의 CD-2,3에서 보존되어 있는 아미노산과 Gly으로 각각 변형하였다. Q116과 H250 아미노산을 각각 Gly, His 및 Gly, Gln으로 변형시킨 결과, 효소반응속도 값(K_(m), V_(max))이 둘 다 변화하여 이 아미노산들은 효소촉매(catalysis site)와 기질친화(substrate binfing site)에 관여하는 아미노산으로 추정된다. N142 아미노산을 Gly과 Asn으로 변형시킨 결과 효소반응속도 값(K_(m), V_(max)) 중 V_(max) 값의 활성이 변화한 것으로 나타났으며 이는 N142 아미노산이 효소촉매 (catalysis site)에 관여하는 것을 의미한다. V215 부위는 Gly, Ala, Leu 으로 변형시켰더니 효소의 활성이 전혀 나타나지 않았고, 이를 SDS-PAGE로 확인한 결과 단백질 발현이 되지 않았다. 이러한 결과는 V215 아미노산은 CD-2,3의 단백질 folding에 중요한 역할을 하는 아미노산인 것을 의미한다. 효소의 비활성값을 보면 특이적으로 Gly으로 유전자 변형한 효소의 비활성값이 wild-type에 비해 2배 이상 감소한 것으로 나타났는데 이는 아미노산 크기가 작은 글리신이 단백질의 고차구조에서 wild-type 아미노산의 빈 공간을 채우지 못해 효소활성의 변화가 크게 나타난 것으로 추정된다. 유전자 변형시킨 효소의 안정성을 확인하기 위해서 효소의 최적 pH와 pH 안정성을 실험한 결과, mutant 단백질들 간의 큰 차이는 관찰되지 않았으며 최적 pH는 7.0-8.0, pH stability는 pH 6.5-9.0에서 약 80% 이상으로 나타나 wild-type과 유사한 것으로 나타났다.

3,4-Dichloroaniline (DCA) has been considered a potential pollutant due to its toxicity and its high production rate. It previously reported the isolation of Pseudomonas sp. KB35B, capable of growth on 3,4-dichloroaniline (DCA) as a sole carbon source. This strain is also able to degrade several chloroanilines and shows a high level of catechol 2,3-dioxygenase (CD-2,3) activity by 3,4-DCA exposure. However, the properties of CD-2,3 were still remained unknown. In attempt to elucidate the characteristics of CD-2,3, the functional studies such as enzyme kinetics, substrate specificities, and catalytic and substrate-binding sites are necessary. In attempt to elucidate the relation between degradation of 3,4-DCA and CD-2,3 activity, a gene, nahH, encoding CD-2,3 was cloned and its properties was characterized. When the amino acid sequences of CD-2,3 were compared to other homologous protein, the CD-2,3 of KB35B was 97% identical to that of Pseudomonas putida G7. The analysis of sequence alignment between two proteins revealed that four amino acids is only different at position 116, 142, 215 and 250, implying that these amino acids may play an important part in the CD-2,3 of KB35B. In order to characterize CD-2,3, mutational analyses were performed with the point mutated CD-2,3 proteins. The point mutations at Q116, N142, V215, and H250 were carried out by site-directed mutagenesis. Each of amino acid was converted into the corresponding residues of the CD-2,3 found in plasmid NAH7 of P. putida G7 or Gly. As a result. it was surmised that Q116 and H250 domain will be a critical amino acid involved in both substrate affinity and catalysis due to the change of K_(m) and V_(max) values. And the substitution of N142 with Asn results in the change of V_(max) values, suggesting that N142 domain will be a critical amino acid involved in substrate catalysis. Also All V215 mutants lack the activity and the expression, implying that this domain may involve in folding of the CD-2,3 of Pseudomonas sp. KB35B. For the physiological properties of wild-type and mutants, it was investigated the pH stability and optimum pH of wild-type and mutants. As a result, the optimum pH range was between 7.0 and 8.0 and the enzymes kept over 80% of its activity up to 24 h in a pH range of 6.5-9.0.