가압 이산화탄소와 역미셀을 이용한 Bovine Pancreas Trypsin의 물질전달 및 회수

Abstract

본 연구에서는 역미셀을 이용하여 단백질 분해효소인 trypsin을 수용상으로부터 유기상으로 추출하였다. 음이온 계면활성제인 AOT를 isooctane에 용해하여 이산화탄소를 이용해 가압한 유기상으로 전달하는 역미셀 추출 공정에서 물질전달속도 및 물질전달계수와 추출 효율을 측정하였다. 단백질 전달에 영향을 주는 주요 인자로 수용액의 pH 및 이온강도, vessel의 압력과 온도, 유기상의 계면활성제 농도를 변수로 하여 단백질의 최적 전달 조건을 고찰하였다. 또한 이러한 변수들에 따라 정추출 후 유기상의 수분함량(W0)을 측정함으로써 역미셀 크기를 짐작할 수 있었으며, pH와 이온강도를 변화시킨 제 2의 수용액상을 이용하여 단백질을 다시 회수시킴으로써 역추출 효율 및 상대효소활성을 측정하여 얻은 결론은 다음과 같다. 1. Trypsin의 물질전달속도는 등전점 이하의 pH 영역에서 점차 증가하다가 pH 5 부근에서 가장 높게 나타났으며, pH가 낮은 산성영역에서는 다소 감소하였다. 수분함량 역시 물질전달속도와 유사한 경향을 나타내었으며, 상대활성도는 pH가 증가함에 따라 점차 증가하다가 등전점 부근인 pH 9에서 가장 높은 상대활성도를 나타내었다. 또한 정추출 효율은 pH가 낮아질수록 증가하다가 산성부근에서 다소 감소하였으며, 역추출 효율은 pH가 높아짐에 따라 증가하였다. 2. 압력에 따른 trypsin의 물질전달속도는 vessel의 압력이 65 bar일 때 가장 빠르게 나타났고, 정추출 효율도 높게 나타났으며, 이산화탄소의 임계압력 부근에서 급격히 감소하여 가장 낮은 값을 나타내었다. 또한 압력이 증가함에 따라 역미셀 용액의 수분함량이 증가하였으며 회수된 상대효소활성은 감소하였다. 3. Trypsin의 물질전달속도 및 정추출 효율은 vessel의 온도가 35oC일 때 가장 높게 나타났다. 수분함량 역시 35oC일 때 가장 높은 수분함량을 나타내었으나 다른 온도의 조건에서도 거의 일정하게 나타났다. 또한 상대효소활성도는 온도에 따라 뚜렷한 차이는 나타나지 않았으나 vessel 온도가 45oC일 때 보다는 25, 35oC일 때 다소 높게 나타났다. 4. 수용상의 이온강도가 증가할수록 trypsin의 물질전달속도는 감소하였고, 역미셀 용액의 수분함량 및 회수된 상대효소활성도도 감소하는 경향을 보였다. 또한 정추출 효율은 이온강도가 낮을수록 높았으며, 역추출은 효율은 이온강도가 증가할수록 높게 나타났다. 5. 음이온 계면활성제인 AOT의 농도가 높아짐에 따라 물질전달속도가 증가하였으며, 80mM 의 AOT의 농도에서 가장 높은 물질전달속도를 나타내었다. 반면 AOT의 농도가 80mM 이상일 때는 물질전달속도가 감소하는 경향을 보였다. 역미셀 용액의 수분함량 및 정추출 효율 역시 물질전달속도와 비슷한 경향을 보였다. 또한 상대효소활성도는 AOT의 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 본 연구에서는 인체에 무해하고 환경오염에 미치는 영향이 적은 이산화탄소를 이용하여 가압함으로써 유기용매의 잔존율을 줄일 수 있음을 제시하였다. 또한 연구결과들을 종합하여 볼 때 trypsin의 추출에서 가압 역미셀 시스템을 이용하였을 때 물질전달속도가 더 빠르고 회수된 효소의 상대활성도 비교적 높게 나타난 것을 보면 기존의 역미셀 공정보다 가압 역미셀을 이용한 추출이 더욱 효과적임을 알 수 있었다. 또한 다른 종류의 염 및 계면활성제, 다양한 impeller의 회전수 등 본 연구에서는 수행하지 못했던 조건에서의 향후 연구가 필요할 것으로 보인다.

Enzyme is a kind of protein with biological activity, and enzymes have been commonly applied in the fields of medicine, food, synthesis, energy resources, and environment. At present, enzyme preparation comes mainly from animals’ organs, extraction of high-grade plants, and fermentation of micro-organisms. No matter where the enzyme preparation comes from, it needs to undergo the steps of separation and purification. In recent years, reverse micelle systems have been extensively studied as a technique for the extraction and purification of proteins. This technique allows the recovery and concentration of a specific protein from a dilute aqueous solution containing other bioproducts. A reverse micelle system consists of aggregates of surfactant molecules containing an inner water core, dispersed in an organic solvent medium. The polar microenvironment inside reverse micelles permits the solubilization of protein while maintaining its native structure. The transport phenomena process of bovine pancreas trypsin between aqueous solutions and AOT (sodium bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate) - isooctane (2,2,4-trimethylpentane) solutions dissolved with pressurized carbon dioxide (CO2) were studied using reversed micelles at a plate system. In this study, it was developed a model for estimating mass transfer of trypsin on the basis of data measured from a flat vessel at pressurized two phases system, an aqueous phase containing protein and an organic phase reversed micelles mixed with CO2. The mass transfer rates from an aqueous phase to a reverse micelle phase were examined for several factors such as pH and ionic strength of aqueous phase, pressure and temperature of vessel, surfactant concentration of organic phase. Also water contents (W0) were determined using organic phase after forward extraction and relative specific activity studied after backward extraction. Mass transfer rates for the extraction of trypsin were measured in a stirred cylindrical vessel. The vessel consists of an inner diameter of 60 mm and a height of 140 mm, containing 4 equi-spaced longitudinal baffles and the interfacial area was 2.827 × 10-3 m2. Two co-axially mounted impellers which were driven independently by magnetic drive were used. In all experiments, the impellers rotated in the same direction. A water jacket was used to control temperature in the range of 25∼45oC. The CO2 pressure in the vessel was regulated by high pressure controller. In the protein extraction utilizing the reversed micelles process, dissolving CO2 in the organic phase improved the mass transfer rate of trypsin in the aqueous phase compared with atmospheric condition. Mass transfer coefficient, K was shown the highest value at the experimental conditions as follow: pH 5 of the aqueous phase, ionic strength 0.1 M of KCl, 65 bar of pressure and 35oC of temperature in the vessel, 80 mM of AOT concentration in the organic phase. Resulting of diminishing the interfacial tension between aqueous and organic phase by pressurized CO2, trypsin of the aqueous phase was able to be transferred to the organic phase easily.