다랑어 육로부터 히스티딘 함유 저분자 펩타이드의 분리 및 기능성 해석

Abstract

수산가공 부산물인 황다랑어와 눈다랑어 골격근으로부터 histidine 함유 저분자 peptide의 효율적인 추출을 위하여 기존에 사용되어지던 추출법의 개선과 새로운 추출법을 이용하여 histidine계 저분자 화합물의 함량 및 산화촉진제의 함량을 비교 검토하고, 저분자 peptide의 기능특성 규명을 위하여 지질 및 단백질의 산화억제와 기능특성에 관해 조사한 결과를 요약하면 다음과 같았다. 1. 황다랑어와 눈다랑어 골격근 모두 anserine이 57.42%와 57.77%로 가장 많은 함량을 나타내었으며, histidine의 경우도 24.98%와 28.93%로 높은 함량을 나타내었다. Carnosine은 2.11%와 1.56%로 다소 낮은 편이지만 기타 아미노산에 비해 높은 함량을 나타내었다. 그 외에도 alanine과 glycine, lysine, taurine 등의 중성 아미노산과 염기성 아미노산이 다량 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 황다랑어와 눈다랑어 골격근이 histidine 함유 저분자 peptide의 추출에 있어 적합한 것으로 나타났다. 2. 가열처리 (80℃, 10min)와 picric acid를 이용한 이온교환 처리에 따른 추출물 중의 단백질과 총철, histidine, carnosine, anserine의 함량은 황다랑어 가열처리구가 52.03±3.93 mg/mL, 16.71±1.02 ㎍/mL, 4.89 mg/mL, 0.352 mg/mL, 4.91mg/mL로 나타났으며 눈다랑어가 53.73±0.23 mg/mL, 17.29±1.40 ㎍/mL, 3.48 mg/mL, 0.077 mg/mL, 6.72 mg/mL이었고, 황다랑어 이온교환 처리구는 25.51±0.36 mg/mL 13.52±1.48 ㎍/mL 2.00 mg/mL 0.158 mg/mL 4.94 mg/mL로 나타났으며, 눈다랑어 이온교환 처리구가 23.89±0.43 mg/mL 15.94±0.68 ㎍/mL 3.23 mg/mL 0.110 mg/mL 6.90 mg/mL으로 각각 나타났다. 가열처리에 비해 이온교환 처리가 단백질의 함량은 35%이상 더욱 효과적으로 감소되었고, 철 함량은 2∼4% 감소되는 것으로 나타났으며, carnosine, anserine의 함량은 비슷한 반면에 histidine의 감소가 더욱 큰 것으로 조사되었다. 3. 분자량 조절에 따른 변화를 살펴보기 위해 원육과 가열처리, 이온교환 처리를 한 추출물을 한외여과를 이용하여 3,000, 500 MWCO (YM3, YC05) 까지 각각 분자량을 조절한 결과 단백질 함량은 한외여과구 (3,000, 500 MWCO)에서 원육에 비해 황다랑어가 65%, 77%로 눈다랑어가 57%, 78%로 감소하였다. 가열처리와 한외여과를 병행하였을 때, 황다랑어가 69%, 80%, 눈다랑어가 70%, 80%감소하였으며, 이온교환과 한외여과를 병행하였을 때, 황다랑어가 83%, 86%, 눈다랑어가 83%, 89%가량 감소하였다. 총철 함량은 원육에 비해 각각 황다랑어가 57%, 72%로 눈다랑어가 52%, 69% 감소하였으며, 가열처리와 한외여과를 병행하였을 때, 황다랑어가 77%, 87%, 눈다랑어가 68%, 81%감소하였으며, 이온교환과 한외여과를 병행하였을 때, 황다랑어가 75%, 86%, 눈다랑어가 76%, 85%가량 감소하였다. 한외여과를 통한 분자량의 조절시 모든 처리구에서 3,000, 500 MWCO에서 histidine, carnosine, anserine 모두가 비슷하거나 약간의 감소하는 경향을 나타내었으며, 단백질과 철의 함량은 크게 감소하는 결과를 나타내었다. 4. CM-cellulose를 이용하여 2차 이온교환을 하였을 때 추출물 중의 단백질과 총철, histidine, carnosine, anserine의 함량은 황다랑어가 6.27±0.26 mg/mL, 5.20±0.21 ㎍/mL, 0.80 mg/mL, 0.208 mg/mL, 4.40 mg/mL로 나타났으며, 눈다랑어가 9.05±0.82 mg/mL, 4.06±0.20 ㎍/mL, 1.62 mg/mL, 0.012 mg/mL, 7.28 mg/mL로 각각 나타났다. 1차 이온교환처리와 비교하여 단백질과 총철, histidine의 함량이 황다랑어가 43%, 73%, 27%, 눈다랑어가 0.4%, 54%, 23% 감소된 반면에, carnosine 과 anserine의 함량은 황다랑어가 22%, 17% 증가하였으며, 눈다랑어 경우 carnosine은 약간의 감소가 있었으나, anserine은 32%가량 증가하였다. 5. 추출물의 동결건조에 따른 함량 변화를 살펴본 결과 황다랑어, 눈다랑어 모두 한외여과를 통하여 원육에 비해 각각 47%, 41%의 단백질 함량의 감소를 나타내었으며, 가열처리와 한외여과를 병행한 경우 60%, 58%, 이온교환과 한외여과를 병행한 경우 63%, 60%, 2차 이온교환 처리구가 68%, 66%의 단백질 함량의 감소를 나타내었다. 철 함량은 황다랑어, 눈다랑어 각각 원육에 비하여 한외여과처리가 58%, 55%, 가열처리와 한외여과를 병행하였을 때 66%, 65%, 이온교환과 한외여과를 병행하였을 때 72%, 69%, 2차 이온교환 처리가 90%, 88%의 철 함량을 감소시켰다. Histidine은 황다랑어, 눈다랑어 동결물 중 2차 이온교환 처리가 원육에 비해 각각 79%, 78%로 감소되었으며, carnosine의 경우 원육에 비해 각 처리구가 모두 감소되는 결과를 나타냈다. Anserine의 함량은 황다랑어 한외여과처리와 가열처리와 한외여과를 병행한 동결물에서 약간의 감소가 있을 뿐, 이온교환과 한외여과 처리구, 2차 이온교환 모두 18%, 23% 증가하였으며, 눈다랑어 동결건조물에서는 한외여과, 가열처리와 한외여과처리구가 각각 16%, 76%증가 하였고, 이온교환과 한외여과 병행처리와 2차 이온교환처리 모두 2.1배 증가하는 결과를 보였다. CM-cellulose 처리구가 철 함량은 가장 낮으면서 동결건조 시 총철 함량에 대한 dipeptide의 비율이 가장 높은 함량으로 나타났다. 6. SDS전기영동을 통하여 추출 조건에 따른 고분자 단백질의 제거를 확인하였을 때, molecular imaging system을 통하여 3.5kD 이상의 고분자 단백질의 제거를 확인하였으며, TLC를 이용하여 동결건조물에서carnosine, anserine 표품과 동일한 Rf값을 나타내었다. HPLC를 이용하여 추출 조건에 따른 변화를 분석한 결과 anserine 과 carnosine 표품은 14분과 15분대에서 peak가 나타남을 확인 할 수 있었으며, CM-cellulose를 이용하여 2차 이온교환을 하였을 때 황다랑어와 눈다랑어 모두 anserine의 peak를 제외하고 다른 잔기의 사라짐을 나타냈다. LC/MS를 이용한 질량분석에서 황다랑어, 눈다랑어 골격근에서 최종 CM-cellulose를 처리한 액상, 분말모두 anserine의 분자량과 동일한 분자량(MW 240)을 가진 물질이 대부분임이 확인되었다. 7. Histidine, 1-methylhistidine, carnosine과 anserine을 포함한 histidine 관련 화합물과 다랑어에서 추출한 Histidine 함유 저분자 peptide는 DPPH 라디칼 소거능력을 지녔고, 농도가 증가함에 따라 효과 또한 증가했다. 다랑어 추출물은 2차 이온교환 처리물이 carnosine과 anserine의 dipeptide와 유사한 결과를 나타냈으며, 가열처리와 한외여과를 병행한 경우와 이온교환과 한외여과 처리를 한 동결물의 경우 ascorbic acid와 유사한 라디칼 소거능을 나타냈다. Histidine 함유 dipeptide 중에서 anserine이 가장 높은 환원력을 나타내었으며, carnosine은 두 번째로 강한 환원력을 나타내었다. Dipeptide와 비교하여 황다랑어, 눈다랑어 추출물이 높은 환원력을 나타내었으며, 농도가 증가할수록 환원력이 증가하였다. 다랑어 추출물 원육에서의 SOD 유사활성은 약했으나, 가열처리와 한외여과를 병행하였을 때, 황다랑어 눈다랑어 추출물이 농도별로 4.0∼19.4%, 5.7∼20.6%로 나타났으며, 이온교환과 한외여과를 병행하였을 때, 8.3∼27.9%, 5.4∼25.0%, 2차 이온교환 처리를 하였을 때, 8.2∼29.5%, 8.6∼32.1%로 활성이 증가하였다. Linoleic acid를 기질로 하여 저장기간에 따른 자동산화의 중간생성물인 과산화물의 변화를 측정한 결과 CM-cellulose의 처리 동결건조물은 ascorbic와 유사하게 지질산화능이 높은 것으로 나타났다. 인체 내의 pH 변화를 고려하여 pH 1.2, pH 3.0, pH 4.2로 조절하여 아질산염의 소거능을 살펴보았을 때, 황다랑어 추출물의 경우 25.14%, 15.09%, 13.71%, 눈다랑어 추출물은 27.44%, 18,28% 18.09%로 pH 1.2, pH 3.0에서 carnosine과 anserine보다 낮지만 pH 4.2에서 histidine 보다 높은 소거능을 보였다. 8. 저분자 peptide를 첨가한 한우 patty의 저장성 평가에서 histidine, carnosine과 anserine, 항산화제인 ascorbic acid, 그리고 다랑어 추출물을 첨가한 patty의 pH 변화는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 이들과 histidine, 대조구를 비교하였을 때 저장 4일 이후 pH의 증가가 감소하는 것을 나타내었다. 육색의 변화를 비교한 결과 적색도 (a*)값에서 다랑어 추출물이 carnosine이나 ascorbic acid 보다는 육색 보존효과가 적지만, anserine과 비슷한 효능을 보이며, 대조구에 비해 10.2% 높은 효과를 나타냈다. 저장기간에 따른 myoglobin 생성 율을 측정한 결과 ascorbic acid가 33.8%로 가장 억제 되었으며, carnosine과 anserine이 거의 동일한 효과를 나타내었다. 다랑어 추출물은 이 보다 3%, 7% 가량 더 met-myoglobin이 생성되었으나 histidine에 비해 12%, 8% 가량 억제되었으며, 대조구에 비해 30%이상 met-myoglobin 생성이 억제됨을 나타냈다. 미생물 (psychrotrophic microorganism)증식에 미치는 효과를 비교한 결과 저장기간에 따른 균수의 유의적인 차이는 없었으나 histidine, 대조구와 비교하여 저장 3일 이후 0.8 log CFU/g의 증식억제를 나타내었다. 9. 황다랑어, 눈다랑어 동결건조 추출물을 5 mg/mL의 농도로 첨가하여 hypochlorite 처리구 (untreated)와 비교하였을 때, 황다랑어의 경우 가열처리 한외여과, 이온교환 한외여과, CM-cellulose처리구가 각각 37.14±0.48%, 33.37±0.92%, 26.29±0.51%, 눈다랑어의 경우 36.11±0.39%, 33.61±0.92%, 23.05±0.21% CO groups이 존재하는 것으로, hypochlorite 처리구와 47.50±0.26%와 비교하여 단백질 CO groups의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. BSA에 hypochlorite와 추출물을 반응시켜 전기영동 한 결과 다랑어 추출물을 첨가하지 않은 구에서는 glycation에 의한 단백질 (BSA)의 band가 줄어드는 것을 볼 수가 있으며, 다랑어 추출물을 첨가한 구에는 이러한 현상이 없는 것으로 보아 다랑어 추출 histidine 함유 peptide가 hypochlorite 처리한 단백질의 글리케이트 반응을 억제하는 결과를 나타내었으며, 농도가 높을수록 변성되지 않은 BSA 밴드가 확인되었다.

To development of extracting process and evaluation of functional properties of histidine-containing low molecular weight (LMW) peptides, such as carnosine, anserine, histidine containing extracts from tuna waste meat. Several method were tested such as heat treatment (80℃, 10min), DOWEX ion exchange (IEC), ultrafiltration (UFP), and CM-cellulose column chromatography (IEC-2). According to different extraction process, decreased pro-oxidants (total iron, protein) and increased functional properties of yellowfin (Thunnus albacares) and bigeye (Thunnus obesus) tuna their undried and freeze dried extracts. For the evaluation of antioxidant activities of histidine containing LMW peptides and free amino acids (histidine, 1-methyl histidine, β-alanine, taurine) and antioxidants (ascorbic acid, BHT) which is scavenging effect on α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl free radical, reducing power, superoxide dismutase (SOD) like activity, inhibition of linoleic acid autoxidation, nitrate-scavenging effect were evaluated. And effects of histidine containing LMW peptides and antioxidants on oxidative processes and pH, meat color (α* value), met-myoglobin reducing activity (% of total sulface myoglobin) and psychrotrophic microbial populations of Hanwoo (Korean Cattle) patty during refrigerated storage at 4±1℃ for 2 weeks. Finally the role of these LMW peptides in the prevention of protein denaturation which attributed to bovine serum albumin (BSA) react with hypochlorite and inhibition to producing advanced glycation end-of products (AGE) through the protein glycation with carbonyl group were researched. 1. In total free amino acid analysis showed that both yellowfin and bigeye waste muscle were anserine involved in high concentration as 57.42% and 57.77%. Histidine were 24.98% and 28.93% involved in total free amino acid. Carnosine content was a little as 2.11% and 1.56%, but this is higher than any other amino acids such as alanine, glycine, lysine, and taurine. 2. Extracts which are heat treated and treated use of picric acid ion exchange chromatography (IEC-1) show contents of protein, total iron, histidine, carnosine and anserine; yellowfin heat treated was 52.03±3.93 mg/mL, 16.71±1.02 ㎍/mL, 4.89 mg/mL, 0.352 mg/mL, 4.91mg/mL respectively. And bigeye heat treated was 53.73±0.23 mg/mL, 17.29±1.40 ㎍/mL, 3.48 mg/mL, 0.077 mg/mL, 6.72 mg/mL respectively. The application of IEC-1 technique to extracts from tuna were similar composition of carnosine and anserine in stead of reducing the protein at 35% and total iron at 2∼4% relatively as against of heat treatment. 3. To examine change of composition with regulation of molecular weight cut off, tuna raw material and the extracts which were heating treated and IEC treated using ultrafiltration permeated (UFP) to the extent of 3000, 500 molecular weight cut off (YM3, YC05 MWCO). Protein contents of UFP (3000, 500 MWCO) was decreased as 65%, 77% yellowfin, 57%, 78% bigeye compared with raw material. Keep pace with heating treated and UFP, protein content decreased 69%, 80% yellowfin, 70%, 80% bigeye tuna. Besides, keep pace with IEC and UFP, protein content decreased about 83%, 86% yellowfin, 83%, 89% bigeye tuna. Content of total iron UFP was decreased as 57%, 72% yellowfin, 52%, 69% bigeye compared with raw material. Heating treated and UFP, protein content decreased 75%, 86% yellowfin, 76%, 85% bigeye tuna. However weakly apparent loss of histidine containing dipeptide. 4. Extracts which were IEC-2 using CM-cellulose showed content of protein, total iron, histidine and anserine; 6.27±0.26 mg/mL, 5.20±0.21 ㎍/mL, 0.80 mg/mL, 0.208 mg/mL, 4.40 mg/mL in yellowfin, 9.05±0.82 mg/mL, 4.06±0.20 ㎍/mL, 1.62 mg/mL, 0.012 mg/mL, 7.28 mg/mL in bigeye tuna respectively. Compared with IEC-UF, content of protein, total iron and histidine decreased 43%, 73% and 27% in yellowfin, 0.4%, 54% and 23% in bigeye tuna, on the contrary increase of content of carnosine and anserine 22%, 17% respectively. 5. Freeze dried (FD)extracts had similar tend to its undried extract, ie. dipeptide contents increased with purification step, but pro-oxidants (total iron, protein) contents decreased. Protein contents of FD-extracts were decreased as 47%, 41% yellowfin and bigeye tuna, heated-UFP was 60%, 58%, IEC-UFP was 63%, 60% and IEC-2 was 68%, 66% compared with raw material. Total iron were decreased as 58%, 55% yellowfin and bigeye tuna, heated-UFP was 66%, 65%, IEC-UFP was 72%, 69% and IEC-2 was 90%, 88% compared with raw material. Decreased pro-oxidants and increased dipeptide contents of their extracts. And IEC-2 freeze dried extract is most raised the content of anserine, in stead of pro-oxidants. 6. Through the result of analysis SDS-PAGE and TLC refinement to purification of histidine containing dipeptide. The peak of anserine and carnosine appeared at 14 and 15 minutes of retention time and the other peaks from impurities that conjectured larger molecular weight than anserine and carnosine were distributed 17-25 and 29minutes in HPLC spectrum. Ion exchange removed impurites in heat treated extracts, more effective than independent use of UFP method. In addition to IEC-2 got rid of impurities in extracts. Both of anserine standard and IEC-2 extracts showed equal molecular weight (MW 240) by LC/MS. 7. Histidine containing compounds such as histidine, 1-methylhistidine, carnosine, anserine and histidine containing dipeptide from tuna increased DPPH radical scavenging effect as to continued to increase as concentrations were increased unlike β-alanine and taurine. And reducing power of tuna FD-extracts and histidine related compounds strengthened with increasing concentration. The tuna extracts activity like SOD of increased with purification step passed on. Tuna FD-extracts were electron donors and could react with free radicals to convert them to more stable state and terminate radical chain reaction. The addition of tuna extracts preventing lipid peroxidation in linoleic acid system. And also possess effective nitrite scavenging activity. 8. Evaluating the inhibition of oxidation changes of Hanwoo patty, addition of histidine containing LMW peptides and antioxidants were antioxidative protection with regard to meat disterioration. On oxidative processes pH, and psychrotrophic microbial populations were no significant differences during the storage period among sample. However meat color, met-myoglobin reducing activity were effective delay of oxidation of meat. 9. Tuna FD-extracts inhibited the formation of carbonyl group; present during the treatment weakly apparent loss of protein carbonyl groups occurred. Role of tuna LMW peptides in the prevention of protein denaturation which hypochlorite-mediated protein cross-linked products as relateved by SDS-PAGE by the migrating bands. It's anti-crosslinking activity continued to increase as concentrations were increased. The results suggest that tuna extracts were representative for an anti-crosslinking agent, protection against production of the cross-linked protein.