담수 관상어에서 분리한 iridoviruses의 분자생물학적인 특성

Abstract

본 연구에서는 담수 관상어 산업에 심각한 경제적 손실을 일으키는 iridoviurs의 교차 감염성 및 정량적 분석을 하고자 하였다. 자연 감염된 담수 관상어와 해산어로부터 각각 ISKNV-like iridovirus와 IVS-1을 분리하였고, RSCR-K2 부위의 band pattern 분석한 결과 해산어에서 분리된 IVS-1은 band가 1개인 single major band (SMB)를 보이는 반면, 담수 관상어에서 분리된 iridovirus는 band가 2개 이상인 multi major band (MMB)가 나타났다. 담수 관상어 iridovirus (FOV)를 sequencing한 결과 156bp, 183bp의 repeating sequence가 확인되었다. 그리고 RSCR-K2 부위에서는 repeating sequence의 addition/deletion현상에 의해 amplicon이 multi 길이로 나타나는 것이 확인되었다. Repeating sequence가 많이 존재한다고 알려진 다른 부위 intergenic region (IGR-RR)을 분석한 결과 inter간의 band 길이는 달랐지만 intra 간에는 모두 SMB로 나타나는 것을 확인했다. 을 또 다른 부위인 MCP, ATPase, PstⅠ, ORF-1 부위를 확인한 결과 MMB 현상은 보이지 않았다. 따라서 이런 현상은 RSCR-K2 만의 특이적인 현상인 것으로 보여진다. 자연 감염에 나타난 MMB와 SMB의 비장 조직을 rock bream과 pearl gourami에 공격 실험한 결과 band pattern 현상이 그대로 유지됐으며 rock bream에 세 번의 passage를 걸친 공격 실험에서 첫 번째 passage를 제외한 두 번째, 세 번째 passage에서는 band pattern 현상이 그대로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. MMB와 SMB으로 공격 실험한 폐사율 결과는 MMB는 rock bream과 pearl gourami 모두에서 100%의 폐사율을 보였으며 SMB에서는 rock bream은 70%, pearl gourami에서는 89%의 폐사율을 보였다. 이는 교차 감염성의 위험성이 매우 크다는 것을 나타내고 있다. real time PCR 결과에서는 MMB와 SMB를 나타내는 rock bream의 비장 조직 1mg을 분리하여 분석하였으며 그 결과 viral copy 수는 MMB group이 7.10E+00, SMB group이 6.84E+00으로 10배 높았다. 이것은 담수 관상어에서 분리된 iridovirus의 감염성과 repeating sequence를 밝힌 최초의 연구이며, viral copy수를 이용한 정량적 분석은 앞으로 담수 관상어 iridovirus의 진단에 방향을 제시할 것으로 기대된다.

In this study we investigatied the molecular characterization of freshwater ornamental fish iridovirus (FOV), known as constraint in freshwater ornamental fish industries. Two iridovirus isolates, ISKNV-like iridovirus and IVS-1, were isolated from freshwater ornamental fish and rock bream (Oplegnathus fasciatus) respectively in Korea. I studied repeating sequence containd region (RSCR-K2) that belong to special genomic region of iridovirus, called K2 region and investigated intergenic region located between RAD 2 and RNRS region. Such as RSCR-K2 and intergenic region, named IGR-RR in this study carried many of repeating sequences. On the PCR for analysis of RSCR-K2 region, in genome of iridovirus obtained variable length of amplicons from a single infected fish. However, IGR-RR region in PCR targeted a IGR-RR region an intergenic region repeated carrying the highest frequency of repeating sequence in the genome of individual, this study obtained only a single length of amplicon. Multi size of amplicons appeared in RSCR-K2 region was derived from the deletion and addition of the repeating fragment of 32, 17, 13 amino acids which was came out much longer repeating sequence compared with that found in IGR-RR region. On the PCR for analysis of MCP, ATPase, PstⅠ, ORF-1 region, this study obtained only a single length of amplicon. So this study determined only RSCR-K2 region possess multi amplicons property. In challenge test, I challenged poly length polymorphism and single length polymorphism of RSCR-K2 even after cross infection to seawater fish, rock bream and freshwater ornamental fish, pearl gourami were not influenced to the pathogenicity of iridovirus from ornamental fish. In challenge test through third passage, band length polymorphism maintained except for first passage experimentation. Cumulative mortality compared with poly length polymorphism and single length polymorphism of RSCR-K2 region, were not significantly different. In quantitative real-time PCR(qPCR) using SYBR Green for the quantitative detection of multi lengths of amplicons and single length of amplicon from ISKNV-like iridovirus. In quantitative PCR targeted MCP region, viral concentration in the infected tissue by an iridovirus carrying a multi length and single length of RSCR-K2 region were not significantly different.