면역자극물질과 이리도 바이러스 감염에 의한 돌돔 면역유전자의 발현

Abstract

본 연구에서는 돌돔의 면역유전자인 Mx gene 과 Cyclooxygenase-2 유전자들을 cloning 하고 이들 면역 관련 유전자들이 어떻게 변화하는지를 분석하여 면역자극물질과 iridovirus 감염에 의해 돌돔에서 일어나는 초기 면역반응을 알아보고자 하였다. 면역자극제로 알려져 있는 Poly I:C 와 LPS를 돌돔에 자극시켜 여러 조직을 통해 면역 유전자의 발현을 관찰 하였다. Mx2의 경우 LPS 보다 Poly I:C에 의해서 더 많이 유도 된다는 것을 알 수 있었다. Sachun type IVS-1 과 능성어 폐사체의 brain으로부터 분리된 VNN virus 를 사용하여 real time PCR과 conventional PCR 을 통해서 면역반응을 분석한 결과 iridovirus의 경우 돌돔의 폐사가 일어나기 시작하는 7일 이후 부터는 면역유전자의 발현이 감소되었으며, VNN 을 돌돔에 공격했을 때는 폐사가 거의 일어나지 않았으며, 인터페론 관련유전자인 Mx2 의 경우 iridovirus를 감염시킨 group에 비해 높은 발현량을 보였다. 같은 실험일 경우라도 아무런 자극을 주지 않는 group의 발현정도에 의해서 발현량의 값이(value) 차이를 보이긴 했지만 증가와 감소하는 경향은 같은 것을 확인하였다. Virus의 replication 속도와 Mx gene 유전자와 염증관련 유전자(IL-1β, Cox-2) 의 발현관계를 알아보기 위해서 먼저 18℃, 25℃ 환경에서 virus 공격실험을 실시하였다. 그 결과 25℃에서 감염 후 7일째부터 폐사가 일어나기 시작하였고, spleen 조직을 이용한 copy number 분석 결과 2.55E+07 viral copies/mg of infected tissue 를 나타냈으며, 18℃에서는 감염 후 7일째 까지 폐사는 일어나지 않았으며, spleen 조직을 이용한 copy number 분석 결과 1.79 E+02 viral copies/mg of infected tissue로 virus 의 복제가 천천히 일어나는 것을 확인하였다. 25℃의 경우 면역유전자 분석결과 7일째 감소하는 현상을 보여지만 18℃에서는 오히려 7일째 증가하는 결과를 보였다. Virus copy number 는 18℃에서는 크게 차이나지 않았지만, 25℃에서는 시간이 지날수록 증가하는 경향을 확인하여, 온도별 virus replication 속도를 확인할 수 있었으며, 늦은 속도로 복제되는 온도에서는 면역유전자가 느리게 발현을 하는 것을 알 수 있었다. 이러한 돌돔의 면역자극물질과 virus 감염에 의한 염증 유전자 및 interferon response의 분석은 어류의 면역학적 연구나 돌돔의 또 다른 유전자 분석연구에 있어서 기초적인 연구 자료로 사용될 것으로 사료된다.

Iridovirus is a major fish pathogen in marine aquaculture of Asian countries including Korea. Despite of many species affected by this pathogenesis, little is known interaction between iridovirus and the fish immune system. The type I interferon (IFN) system is one of the most important mechanisms for antiviral defense. In the type I IFN response, many IFN-related proteins are induced for establishing an antiviral state. Mx proteins have been shown to inhibit virus replication. Interleukin-1β(IL-1β) is a major mediator of inflammation and stimulates and enhances the expression of several genes that are characteristically expressed during inflammation. Increased IL-1β has been attributed to the induction of novel Cyclooxygenase (Cox) isoform (Cox-2), distinct from the well characterized consititutive activity (Cox-1) and playing an important role in immune regulation. Cox-2 gene is induced by various inflammatory signals, including cytokines, growth factors, and lipopolysaccharide. Fish have a body temperature that is essentially the temperature of the surrounding water so that their entire physiology, including immune functions, is influenced by environmental temperature. We have studied two important innate immune genes, Mx gene and Cox-2 gene, were cloned and sequence in rock bream. Expression of those two genes were analyzed in vivo condition stimulating with LPS and poly I:C .The effect of iridovirus infection on the expression of immune genes, IL-1β, Mx and Cox-2 genes, in rock bream in laboratory were analyzed. Studies in rock bream immune response after iridovirus and poly I:C injection at 18℃ when compared to those responses at 25 ℃. When rock bream was injected with LPS and poly I:C intraperitoneally, the peak level of expressed immune genes in head kidney cells and Liver cell was appeared at 1 day post injection. Moreover the levels of immune genes in rock bream infected with iridovirus was higher than that of non-infected rock bream, negative control. The iridovirus infected group had only small elevation in the expression of immune genes on day 1 and up-regulated 3 days post infection, and decreased thereafter. The susceptibility of fish to disease is partly dependent on their environment, in particular on water temperature. The pathological situation in fish depends both on temperature dependent immune system regulation and on pathogen growth. Lower water temperature caused a later increased level of Mx gene which peaked on 7 days post infection of iridovirus.