생체활성물질들을 이용한 성체줄기세포의 특성연구

Abstract

줄기세포란 적절한 신호에 따라서 자기재생과 특정세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 전구세포이다. 이러한 줄기세포는 화합물을 이용하여 원하는 세포로 분화를 시키는 것이 가능하다면 이는 분화 메커니즘을 밝히는 과학적 의미분 아니라 특정 질환에 대한 신약으로서의 개발이 가능하다. 저분자 화합물을 이용하여 배아줄기세포를 운동뉴런으로 분화시키는 연구는 Jessell 등에 의해 수행되었다.1-7 또한 최근에 이러한 중배엽성 줄기세포가 외배엽성인 신경세포로 분화되었다는 연구와 이 세포를 이용하여 신경질환을 치료하고자 하는 노력이 끊이지 않고 있다.17-19 외배엽세포는 BMP, FGF와 Wnt의 신호전달을 조절함으로서 초기 선단신경특성을 가지게 된다. 이 선단신경 전구체는 레티노익 산(RA)과 같은 저분자 화합물에 의해서 척수위치특성을 가지게 된다. 앞서 연구된 RA의 경우 다양한 종류의 전구세포들을 분화시킬 수 있는 매우 유용한 물질이지만 다면발현성을 띄기 때문에 줄기세포를 좀더 정교하게 조절할 수 있는 합성신약물질을 찾고자 한다. 본 연구에서는 합성신약후보물질들을 이용하여 골격근유래 간엽줄기세포를 신경세포로의 분화를 유도하였다. 이러한 후보물질을 처리하여 골격근유래간엽줄기세포가 신경세포로 유도되어져 신경세포에 특이적 단백질인 NSE와 희돌기아교세포에 특이적인 CNPases가 모두 발현하는 것을 확인하였고 또한 이는 전형적인 신경세포의 형태를 가짐을 확인하였다. 현재 줄기세포의 분화를 유도하는 다양한 화합물을 스크리닝 중에 있으며 신경, 골, 연골로의 분화 연구가 진행 중이다.

In chapter 2, In this study, we examined the use of polyethyleneimine (PEI) as a carrier for gene delivery in human adipose tissue-derived stem cells (hADSCs). These multipotent cells can form bone, cartilage, adipose, and other connective tissues. In primary culture, hADSCs are fibroblastic in appearance in primary culture, and they show a high rate of proliferation for at least five passages. Immunophenotyping showed that these cells are positive for the mesenchymal stem cell markers CD44 but negative for the hematopoietic cell surface markers CD45, and also we examined the use of polyethyleneimine (PEI) as a non-viral gene carrier and lipofectamine 2000 as control for rat pheochromocytoma PC-12 cells. The complex formation of PEI and DNA or lipofectamine and DNA was characterized by gel electrophoresis and measurement of particle size and surface charge. A gradual increase in surface charge (from 0.7 to 43 mV) and a gradual decrease in particle size (from 900 to 130 nm) was observed in the PEI?DNA complex with higher PEI concentrations. The cytotoxicity of PC-12 cells for lipofectamine?-DNA complex was similar to PEI?-DNA complex at N: P charge ratios of 4 and 8. Transfection efficiency was 14% for lipofectamine and 15% for PEI. At low N: P ratio, DNA condenses poorly, so the particle size tends to be large and polydispersed, resulting in poor transfection efficiency. Meanwhile, a high N: P ratio results in high transfection efficiency and cytotoxicity. Transfected PC-12 cells showed the generation of neurites from transfected PC-12 cells in the presence of NGF, indicating the differentiation of PC-12 cells. NGF-differentiated PC-12 cells were transfected by PEI?-DNA complex of N: P charge ratio 8. From real-time imaging for transfection, the enhanced green fluorescent protein (EGFP) started to localize in the nuclei of PC-12 cells at 5 h and localized in the cytoplasm from 15 h. Our study demonstrates that PEI or lipofectamine may be applied as an effective gene carrier for PC-12 cells. In chapter 3, To screen for small molecules inducers of neuronal differentiation, rat muscle-derived stem cells (rMDSCs) isolated from adult female Fischer rat were used. Neuronal differentiation were analyzed with immunohistochemistry staining of Tuj1, immunofluorescence staining of NSE and CNPase. In addition, we confirmed that gene expression of neuronal specific marker such as Tuj1 and NSE by RT-PCR. It has been shown that rMDSCs can differentiate into neuron and oligodendrocyte in vitro by small molecules as small molecules A and B.