Biological activities of gentisic acid and coenzyme Q9 in Termitomyces albuminosus on the inflammation: obesity-related and mucosal

Abstract

계종버섯 (Termitomyces albuminosus)은 흰개미들이 계종버섯을 키워 영양분을 섭취하는 버섯이라하여 흰개미버섯으로도 불려진다. 계종버섯에 포함된 다당류, 단백질, 페놀 화합물 등의 다양한 구성 성분에 의해 항암효과, 항산화효과, 면역 증강 효과 등이 있다고 알려져 있으며, 따라서 전통적으로 약재로도 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 계종버섯의 약리학적 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 계종버섯에 존재하는 겐티스산과 코엔자임Q9의 염증에 대한 효과를 조사하였다. 겐티스산의 비만 유래 염증에 대한 효능을 확인하기 위하여, 먼저 리포다당류에 의해 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 항염증 효능을 확인하였다. 겐티스산은 리포다당류에 의해 생성되는 염증 유발 효소인 iNOS와 COX-2 및 이 효소들이 생성하는 산화질소와 PGE2의 발현을 억제하였다. 주요 염증성 사이토카인인 TNF-α, MCP-1, 인터루킨의 RNA 발현량 역시 겐티스산 처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 염증 반응에서 가장 주요하게 작동하는 전사인자인 NF-κB의 인산화는 감소하였으며, IκB의 인산화에 따른 분해 역시 겐티스산에 의해 억제되었다. 또한 MAPK (ERK, p38 MAPK, JNK)의 인산화에 따른 활성화 역시 겐티스산 처리에 의하여 감소하였다. 이 결과들에 따라 겐티스산이 리포다당류에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서의 염증 반응을 억제하는 것을 확인하였다. 다음으로, 겐티스산의 3T3-L1 세포에서의 지방세포 분화 과정 억제능을 확인하였다. 겐티스산 처리에 따라 지방세포 분화에 따른 지질과 중성지방의 축적이 억제되었고, 지방세포 분화 과정의 주요 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 RNA와 단백질 발현 또한 억제되었다. 지질 합성에 관여하는 인자들인 LPL, aP2, FAS, SREBP1 역시 RNA 및 단백질 발현이 겐티스산 처리에 따라 감소하였다. 지방세포 분화에 관여하는 주요 신호전달 경로인 PI3K–Akt–mTOR의 인산화가 억제되었으며, 반대로 지방세포 분화를 억제하는 β-catenin의 활성은 겐티스산에 의하여 증가하였다. 따라서 겐티스산이 효과적으로 3T3-L1 세포에서의 지방세포 분화 과정을 억제하는 것을 확인하였다. 마지막으로 겐티스산의 비만 유래 만성 염증에 대한 효능을 알아보기 위하여 대식세포와 지방세포의 공배양 실험 방법을 사용하였다. 겐티스산은 대식세포와 지방세포의 상호작용에 의해 생성되어 비만 유래 염증 반응에 주요하게 관여하는 인자인 MCP-1, TNF-α, 유리지방산의 발현을 억제하였다. 또한 항염증 아디포카인인 아디포넥틴의 RNA 발현을 증가시키고, 염증성 아디포카인인 레지스틴, 인터루킨-6, MCP-1의 발현 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β의 발현을 감소시켰다. 반대로 항염증성 사이토카인인 인터루킨-10의 RNA 발현은 겐티스산 처리에 의해 증가하였다. 겐티스산 처리에 따라 대식세포의 M1 상태를 나타내는 유전자인 CD11c와 CCR7의 발현량은 감소하였으며, M2 상태를 나타내는 CD206과 아르기나아제1의 발현은 증가하였다. 따라서 GA는 염증성 아디포카인과 사이토 카인의 발현 조절 및 대식세포의 M2에서의 M1으로의 상태 전환을 억제함으로서 비만 유래 만성 염증에 대한 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 코엔자임Q9의 경우 피오사이아닌에 의해 유도되는 인간 기관지 표피 세포에서의 점액 과생산에 대한 효과를 확인하였다. 코엔자임Q9은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으며, 피오사이아닌에 의해 생성된 세포 내 활성산소를 감소시켰다. 점액의 구성 성분인 두 종류의 뮤신인 MUC5AC와 MUC5B는 코엔자임Q9 처리에 따라 RNA와 단백질 발현량이 감소하였으며, 반대로 뮤신 생성의 억제인자인 FOXA2의 경우 발현이 증가하였다. 또한 뮤신 생산에 관여하는 EGFR 신호전달 체계의 구성 단백질인 EGFR, Akt, ERK의 인산화를 억제하였다. 따라서 코엔자임Q9이 피오사이아닌에 의해 유도되는 기도 폐쇄를 억제하는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구에서는 계종버섯에 존재하는 겐티스산과 코엔자임Q9의 비만 유래 염증과 점액 과생산에 대한 효능을 확인함으로서, 항염증 효과를 증명하였다. 이 결과는 겐티스산과 코엔자임Q9의 항염증 제제로서의 활용 및 계종버섯의 약리학적 사용에 대한 전망을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.

Termitomyces albuminosus, a mushroom and obligate symbiont of termites, has been used as a traditional medicinal agent because of its various biological activities, including anti-tumor, antioxidant, and immune-enhancing effects attained from its components, such as polysaccharides, proteins, and phenolic compounds. To further investigate the pharmaceutical activities of T. albuminosus, the effects of two components in this mushroom, gentisic acid (GA) and coenzyme Q9 (CoQ9), on inflammation were examined. To investigate the effects of GA on obesity-related inflammation, firstly, anti-inflammatory effects of GA in LPS-stimulated RAW 264.7 cells were investigated. GA suppressed the expression of major LPS-induced pro-inflammatory enzymes, such as iNOS and COX-2 and their products, NO and PGE2. RNA expression of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α, MCP-1, and ILs, was inhibited by GA treatment. Phosphorylation of NF-κB, a crucial transcription factor for inflammatory responses, was down-regulated in the GA-treated group, and nuclear translocation of NF-κB was suppressed. Additionally, phosphorylation-induced IκB degradation was inhibited in GA-treated groups. GA effectively suppressed the phosphorylation and inhibited the activation of MAPKs (ERK, p38 MAPK, and JNK). These results indicated that GA could attenuate LPS-stimulated inflammatory responses via controlling the major pro-inflammatory factors and NF-κB–MAPKs signaling pathway in RAW 264.7 macrophages. Secondly, the anti-adipogenic activity of GA was examined in 3T3-L1 cells. GA inhibited lipid and triglyceride accumulation during adipogenesis. The RNA and protein expression of crucial adipogenic transcription factors, such as C/EBP α and PPAR γ, was down-regulated. Both RNA and protein expression levels of lipogenesis-related factors, including LPL, aP2, FAS, and SREBP1, were suppressed by GA treatment. The phosphorylation of PI3K–Akt–mTOR pathway proteins, as pro-adipogenic factors, was inhibited by GA treatment. In contrast, the activity of β-catenin, an anti-adipogenic factor, was stimulated in GA-treated groups. These results verified that GA successfully inhibited adipogenesis by down-regulating major adipogenic transcription factors and PI3K–Akt–mTOR pathway and activating β-catenin. Lastly, to determine the effects of GA on the obesity-related chronic inflammation, a macrophage–adipocyte co-culture system was used. GA treatment suppressed the secretion of major obesity-related inflammatory factors, such as MCP-1, TNF-α, and FFAs, caused by macrophage–adipocyte interactions. GA treatment increased the RNA expression of adiponectin, an anti-inflammatory adipokine. Conversely, GA suppressed the RNA expression of pro-inflammatory adipokines, such as resistin, IL-6, and MCP-1, and attenuated that of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-1β, at the RNA level. In contrast, the anti-inflammatory cytokine, IL-10 was up-regulated by GA treatment. Moreover, the mRNA expression of M1-state genes, such as CD11c and CCR7, were suppressed and M2-state genes, including CD206 and Arg-1, were increased in the GA-treated group. These results indicated that GA inhibits obesity-related chronic inflammatory responses via controlling pro-inflammatory adipokines and cytokines and preventing macrophage conversion from M2 to M1 polarization. The effects of CoQ9 on mucus hypersecretion were examined in PCN-stimulated NHBE cells. CoQ9 showed DPPH radical scavenging activity and decreased the PCN-induced ROS level in NHBE cells. RNA and protein expression of mucins, such as MUC5AC and MUC5B, was inhibited by CoQ9 treatment. Conversely, RNA and protein levels of FOXA2, an inhibitor of mucin expression, were increased in the CoQ9-treated group. EGFR signaling promotes the mucin expression, and CoQ9 treatment suppressed phosphorylation of EGFR, Akt, and ERK proteins. These results indicated that CoQ9 could prevent airway obstruction by PCN-mediated mucin hypersecretion. In conclusion, this study verified that the anti-inflammatory activities of GA and CoQ9 from T. albuminosus on obesity-related inflammation and mucosal hypersecretion, respectively. These results can aid in developing GA and CoQ9 as new anti-inflammatory agents and provide new pharmaceutical applications for the mushroom of T. albuminosus.