연어(Oncorhynchus keta)로부터 Anserine의 추출 및 기능 특성 해석

Abstract

수산동물을 원료로 한 천연 anserine의 추출을 위해 여러 추출방법을 이용하여 연어로부터 anserine을 추출하였으며 각 추출방법에 따른 불순물(protein, iron)과 anserine의 함량변화를 살펴보았다. 또한 연어로부터 추출한 anserine의 기능적 특성을 확인하기 위하여 항산화능 실험 및 단백질 변성에 미치는 영향에 대하여 조사하였으며 그 결과는 다음과 같다. 1. Anserine 추출용 시료로서 연어의 적합성을 확인하고자 아미노산을 분석한 결과 총 33개의 아미노산이 검출되었는데 이 중 histidine 함유 디펩타이드 중 anserine은 육 100g당 1070.51mg의 함유로 전체 아미노산 중 약 43.06%를 차지하는 것으로 나타났으며 그 외 histidine과 carnosine은 39.29mg, 2.68mg으로 anserine에 비해 소량 존재하였으며 이로써 연어가 anserine의 추출용 시료로서 적합하다는 것을 확인하였다. 2. Anserine 추출공정 중 가열 처리온도에 따른 단백질, 총철, anserine의 함량변화를 조사한 결과 비가열처리구의 경우, 단백질함량, 총철함량과 anserine함량이 각각 23.64±0.21mg/mL, 16.20±0.09μg/mL, 5.47±0.22mg/mL로 나타났다. 60℃ 가열처리구의 함량 변화는 7.40±0.39mg/mL, 2.32±0.02μg/mL, 5.20±0.63mg/mL이었고, 80℃ 경우 7.64±0.04mg/mL, 1.20±0.12μg/mL, 5.21±0.15mg/mL로 분석되었다. 100℃ 처리구는 7.04±0.28mg/mL, 0.68±0.02μg/mL, 4.04±0.31mg/mL로 나타났다. 60℃, 80℃, 100℃ 가열처리구는 비가열처리구에 비해 단백질함량이 약 69%, 69%, 71% 감소되었으며 총철함량은 약 86%, 92%, 96% 감소하였다. Anserine의 함량은 60℃, 80℃의 경우 약 7% 정도 감소하였고, 100℃의 경우 약 26% 정도 감소를 나타냈다. 3. 가열처리 후 각 추출물을 한외여과를 통해 분자량을 조절하였다. 비가열 처리구의 경우 한외여과를 행했을 때 단백질의 함량이 약 81% 감소되었다. 60℃, 80℃, 100℃ 한외여과 처리구는 가열처리만 한 실험구에 비해 각각 31%, 41%, 33% 정도 단백질 함량이 감소되었으며 총철함량은 비가열처리구의 약 97%를 감소시켰고 60℃, 80℃ 100℃의 경우 가열처리구의 약 94%, 85%, 80%를 감소시켰다. Anserine 함량의 경우 비가열 처리구에 비해 한외여과 처리구가 43% 감소를 나타냈으며, 가열처리구에 비해 50%, 36%, 39% 정도 감소하였다. 4. Dowex 1×8을 이용하여 1차 이온교환을 하고 그 추출물을 이용하여한외여과를 통해 분자량을 조절한 뒤 CM-cellulose를 이용하여 2차 이온교환을 하였다. 그 결과 1차 이온교환 추출물의 단백질함량, 총철함량, anserine함량은 7.30±0.26mg/mL, 0.46±0.01μg/mL, 6.38±0.31mg/mL로 분석되었다. 이는 비가열 처리구의 단백질과 총철함량을 약 69%, 97% 감소시킨 반면 anserine의 함량은 약 16% 증가시켰으며 60℃, 80℃, 100℃ 가열처리와 단백질 함량은 큰 차이가 없었으나 총철함량이 80%, 61%, 32% 감소되었고 anserine의 함량을 각각 22%, 20%, 57% 증가를 나타냈다. 이온교환 추출물을 한외여과 했을시 단백질, 총철 및 anserine 함량은 45%, 91%, 33% 감소하였는데 이는 비가열처리구와 가열처리구에 비해 단백질, 총철함량이 낮은 반면 anserine 함량은 가장 높았다. 2차 이온교환 추출물은 1차 이온교환 및 한외여과 처리한 것에 비해 단백질 함량이 약 70% 낮아졌으며 총철함량의 경우 유의적인 차이가 없었고 anserine의 경우 약 12% 감소되었으나 비가열처리나 가열처리 및 한외여과 추출물에 비해 상대적으로 높았다. 5. 여러 방법으로 추출한 연어추출물을 전기 영동한 결과 많은 밴드가 관찰된 비가열처리 추출물에 비해 가열처리와 한외여과처리, 이온교환 처리 추출물에서 단백질 밴드가 많이 감소된 것을 확인할 수 있었다. HPLC 분석에서 anserine 표품은 13분대에 peak가 관찰되었으며 전체적으로 연어 추출물에서는 13분대에 anserine peak가 확인되었으나 15 ~19분대에 다른 peak들이 관찰되었다. 가열처리와 한외여과, 1차 이온교환을 통해 15~19분대 사이에 존재하던 peak들이 감소되는 것을 확인할 수 있었으나 그 감소 정도는 미비하였다. 2차 이온교환 추출물의 경우 anserine 외의 15~19분대의 peak가 제거되어 연어 추출방법 중 1, 2차 이온교환 및 한외여과 처리를 병행한 것이 단백질 잔여물 제거 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 그리고 LC/MS를 이용하여 표품 anserine과 1차 이온교환 및 한외여과처리 추출물, 2차 이온교환 추출물을 분석한 결과 모두 동일한 분자량(M.w 240)을 가지는 물질로 확인되었다. 6. 연어로부터 추출한 anserine의 항산화능 평가를 위해 1차 이온교환 후 한외여과 및 2차 이온교환 추출물인 IEC-B 실험구와 합성 anserine, β-alanine, 1-methylhistidine, taurine, ascorbic acid, BHT를 대조구로 DPPH 라디칼 소거능, 환원력, 금속 킬레이트능, SOD 유사활성 실험을 하였다. DPPH 라디칼 소거능 결과 대조구와 anserine 모두 농도 증가에 따라 라디칼 소거능이 증가하였으며 BHT가 가장 높은 소거능을 나타냈다. 합성 anserine은 농도 증가에 따라 9.30±0.65~ 28.23±0.24%를 나타냈으며 연어 추출 anserine인 IEC-B 추출물은 7.30±1.13~31.05±0.17%를 나타내 BHT, ascorbic acid에 비해 소거능이 낮으나 두 실험구와 비교했을 때 약 37%, 49% 정도의 소거능을 나타냈다. 환원력 또한 첨가농도에 따라 증가하였으며 BHT와 ascorbic acid가 높은 환원력을 나타냈고, 그 외 실험구 중에서는 합성 anserine과 연어 추출 anserine인 IEC-B 실험구가 높았으며 유의적으로 동일한 환원력을 나타냈다. 금속 킬레이트능은 BHT, ascorbic acid 순으로 높았으며 합성 anserine과 연어 추출 anserine의 경우 ascorbic acid와 유사한 금속 킬레이트능을 나타냈다. 또한 SOD 유사활성에서는 연어 추출 anserine이 BHT와 ascorbic acid에 비해 낮았으나 농도 증가에 따라 증가하는 경향을 나타냈다. 7. 합성 anserine, 연어 추출 anserine, ascorbic acid, BHT를 이용하여 과산화물가와 TBARS를 실험하였다. 저장기간 중 linoleic acid의 과산화물가는 큰 폭으로 증가한 반면 연어 추출 anserine을 첨가한 경우 과산화물가의 증가가 억제되는 경향이 나타났으며, 이는 TBARS 실험 결과와 유사한 경향을 나타냈다.. 8. pH 1.2, 4.2, 6.0으로 pH 조건을 달리하여 합성 anserine과 연어 추출 anserine인 IEC-B의 아질산염에 대한 소거능을 실험한 결과 ascorbic acid가 가장 높은 소거능을 나타냈고 합성 anserine과 연어 추출 anserine 모두 유사한 소거능을 나타냈으며 모든 실험구는 pH가 낮아질수록 높은 소거능을 나타냈다. 9. Ovalbumin에 hypochlorite와 연어로부터 추출한 anserine을 0.5, 1, 2, 3, 4mg/mL의 농도로 첨가하였을 때 1차이온교환 및 한외여과처리 추출물은 농도에 따라 carbonyl group이 11.02±0.81, 18.44±1.94, 29.16±2.18, 39.43±1.06, 50.02±1.19% 감소하였다. 또한 2차이온교환 추출물의 경우 carbonyl group이 6.15±0.34, 16.19±0.82, 26.69±0.69, 33.28±1.96, 42.78±0.94% 감소하였다. 또한 연어 추출물을 1, 4mg/mL의 농도로 첨가하여 hypochlorite로 반응시켜 변성된 단백질을 전기영동한 결과 hypochlorite 처리를 하지 않은 ovalbumin은 단백질 밴드가 선명하게 나타났으나 연어 추출물을 첨가하지 않은 hypochlorite 첨가구는 ovalbumin의 밴드를 관찰할 수 없었다. 1, 4mg/mL의 농도로 연어 추출물을 첨가한 실험구에서는 무처리한 ovalbumin 밴드와 동일한 단백질 밴드가 나타났다.

Antioxidantive activity of food ingredients is one of the important biofunction activities which have been recently focussed on, so lots of studies about antioxidants have been investigated. First of all, antioxidants can be divided into two groups of natural and synthetic antioxidants. Natural antioxidants are limited for industrial utilization because of expensive cost, characteristic odor and color, but synthetic antioxidants put it to good use because of its cheap price and excellent antioxidant activity. However, synthetic antioxidants have defects that give rise to such side effects as hepatomegaly, carcinogenesis possibility and others. Accordingly, lots of studies about natural antioxidants which are nontoxic and have superior antioxidant activity are in progress. Among them, low molecular peptides extracted from muscles of domestic animals and poultries impressed the people and lots of studies about their antioxidant activities are going on. However little studies on searching, extraction, antioxidative activity for the natual antioxidant which are produced from marine organism resources are investigated yet. Anserine of dipeptide combined with β-alanine and 1-methylhistidine is reported to have antioxidant activity. A large amount of free anserine is found from white muscles of migratory marine fish such as salmon, tuna and bonito. However, only possibility about effectiveness of anserine on antioxidative activity is presented. So we think lots of studies related to the anserine should be investigated. In this work, we have studied the extraction methods of reducing the prooxidants (total iron, protein) and the evaluation for the physiological functions of anserine extracted from salmon. For development of extraction process, several methods were tested such as heat treatment (60℃, 80℃, 100℃), ion exchange chromatography (Dowex 1×8), ultrafiltration (UF) and CM-cellulose column chromatography. For the evaluation of functional activities of anserine, scavenging effect on 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical, reducing power, superoxide dismutase(SOD) like activity, inhibition of linoleic acid autoxidation, nitrite scavenging activity were measured. Another evaluation of anserine is the prevention effect against protein denaturalization which attributed to ovalbumin reacted with hypochlorite inhibition to produce advanced glycation end products through the protein glycation with carbonyl group. The main results are shown in the below contents. 1. Among total free amino acids of salmon muscle, anserine, histidine and carnosine were 43.06%, 1.58% and 0.10% respectively, showing the highest amount of anserine. Therefore, salmon is a good source for anserine extraction. 2. Protein, total iron and anserine contents of salmon extracts are as follows; 23.64mg/mL, 16.20μg/mL, 5.47mg/mL at non heating extracts, 7.40mg/mL, 2.32μg/mL, 5.20mg/mL at heating extraction of 60℃, 7.64mg/mL, 1.20μg/mL, 5.21mg/mL at 80℃ and 7.04mg/mL, 0.68μg/mL, 4.04mg/mL at 100℃ respectively. Contents of protein and total iron were decreased by heat treatment and ultrafiltration permeation (UFP). But anserine content slight declined by UFP. The application of primary ion exchange method (Dowex 1×8) to extracts from salmon increased up to 16% for the content of anserine. Protein and total iron contents of primary ion exchange extracts were decreased 70% and 98%, repectively, by UFP. Secondary ion exchange (CM-cellulose) treatment after primary ion exchange and UFP showed lower anserine content than primary ion exchange extracts. However, contents of impurities (protein, total iron) was lower than all other salmon extracts. Therefore, primary ion exchange, UFP and secondary ion exchange method were determinated as the best extraction process in this work. 3. The peak of anserine appeared at 13 minutes of retention time and other peaks distributed between 15~19 minutes in HPLC analysis. Heat treatment, UFP, primary ion exchange chromatography methods decreased other peaks at 15~19 minutes. Secondary ion exchange (CM-cellulose) for salmon extract removed impurities. In addition to primary ion exchange and UFP, secondary ion exchange got rid of much more impurities in extracts. Both of standard anserine and salmon anserine from this research showed equal molecular weight by LC/MS. 4. As a result of DPPH radical scavenging activity, the activity of salmon anserine increased from 7.30% to 31.05% with concentration addition. Reducing power of salmon anserine increased as the concentration increased. Metal chelate activity, SOD like activity showed similar results. The addition of anserine suppressed increase of peroxide value for linoleic acid during storage time. TBARS experiment showed similar results. Salmon anserine inhibited the formation of carbonyl group and this tendencies increased with the concentration. The result of gel electrophoresis of cross linked protein by hypochlorite salmon anserine inhibited protein degeneration. Finally, on the basis of these properties, salmon anserine could be applied as a natural antioxidant.