Morphological and molecular characterization of the marine thecate dinoflagellate genus Heterocapsa from Korean coastal waters

Abstract

The genus Heterocapsa composed of marine thecate, phototrophic dinoflagellates including cosmopolitan and harmful bloom-forming species. In Korea, a number of Heterocapsa species including harmful species have been reported from coastal waters, particularly, the bloom of H. steinii (as H. triquetra) frequently occurred. In this study, I found unidentified Heterocapsa species from the Busan coastal water of Korea. As most Heterocapsa species had difficulty in classification species by small cell size (< 20µm) and sharing thecal plate formula, I examined body scale fine structure and molecular phylogeny as well as morphological features to identify the species. In this study, I examined 1) the new Heterocapsa species with intraspecific variation of body scale fine structures and 2) cryptic speciation of H. pygmaea complex that were morphologically indistinguishable. In chapter 1, I established Heterocapsa busanensis sp. nov. from Yongho Bay of Busan. Using a clonal culture strain of this dinoflagellate, its cellular morphology was investigated with light and electron microscopy. Cells were ellipsoid with composing of a conical episome and a rounded hyposome. A large elongated nucleus placed in the right side of the cell, while a single spherical pyrenoid surrounded by a starch sheath situated in the episome or near the cingulum of the cell. A single reticulate chloroplast located peripherally in the cell. Overall, the morphological features of H. busanensis were very similar to those of H. circularisquama and H. illdefina. Transmission electron microscopic examination of whole mounts revealed that the isolate had two body scale types, one of which was a complex, three-dimensional, fine structure distinct from other Heterocapsa species, whereas the other simpler type was structurally similar to the scales of H. horiguchii. Molecular phylogeny based on rRNA sequences revealed that the isolate was distantly related to morphologically similar species, but formed a sister lineage to H. horiguchii, a species characterized by a similar body scale morphology. Therefore, based on morphological and molecular data, we suggested that this taxon is a new species within Heterocapsa genus. In chapter 2, I explored the cryptic speciation of H. pygmaea complex including strains isolated from Korean coastal waters. Morphology of the Korean strains were examined using light and transmission electron microscopic observations and analyzed molecular sequences of the ITS and LSU rRNA gene regions. The strains displayed identical morphology to the original type of H. pygmaea (USA), but were genetically different, suggesting the cryptic speciation in H. pygmaea stains. Molecular phylogenetic analyses showed that H. pygmaea complex formed a clade including three ribotypes (designated as A, B, and C) and H. bohaiensis. The rDNA sequences of these ribotypes revealed a clear separation between USA, Europe, and Korea, and we found genetic p-distances exceeding species-level divergences among these ribotypes. Furthermore, The ITS-2 secondary structures displayed several CBCs (compensatory change on two sides of a helix pairing) and Hemi-CBCs compared to ribotypes. The results of the present study suggested that there were the variation of species-level among ribotypes of H. pygmaea complex.

유해적조종과 국제적으로 분포하는 종을 포함하고 있는 Heteocapsa 속은 해양생태계에서 중요한 와편모류이다. 한국에서도 H. steinii 의 적조와 유해적조종을 포함하는 약 10종의 다양한 종들의 출현이 알려진 바 있다. 하지만 대부분 Heterocapsa 종들은 작은 세포의 크기와 공통된 세포판에 의해 종 분류의 어려움을 가지며, 따라서 정확한 식별을 필요로 한다. 본 연구는 한국 연안으로부터 분리한 Heterocapsa 종들의 정확한 식별과 분류를 위한 형태학 및 분자계통학적 분석을 실시하여, 1) 신종 Heterocapsa 발굴 및 종내 body scale 변동과 2) 형태적 특징으로 식별할 수 없는 Heterocapsa 의 종분화에 대한 연구를 수행하였다. Chapter 1에서는 부산 용호만에서 분리한 신종, Heterocapsa busanensis 를 연구하였다. Heterocapsa busanensis 의 신종 여부를 확인하기 위하여 광학현미경, 주사/투과 전자현미경으로 형태적 특징을 분석하였다. 크고 연장된 핵은 세포의 왼편에 위치하였고, 하나의 그물 형태의 엽록체는 세포의 주변부에 위치하였다. 또한 구형인 하나의 피레노이드는 상각 또는 가로 홈에 가까이 나타났다. 종 (species) 수준의 분류키가 되는 H. busanensis 의 body scale 은 두 가지의 유형으로 관찰되었다. 조금 더 복잡한 형태의 body scale 은 지금까지 보고된 body scale 들과 다른 구조를 가졌으나, 간단한 구조의 body scale 은 H. hoirghuchii 의 body scale 과 비슷한 구조를 나타냈다. rRNA 염기서열들의 분자계통수 분석에서 비슷한 형태의 body scale 을 가진 종들이 근연관계를 나타냈고, H. busanensis 는 body scale 의 구조가 가장 유사하였던 H. horiguchii 와 근연종으로 나타났다. 따라서 형태/분자적 분류 분석 결과를 토대로 Heterocapsa busanensis 를 신종으로 판단하였다. Chapter 2에서는 한국에서 분리한 형태적으로 구분할 수 없는 H. cf. pygmaea 를 연구하였다. 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 바디스케일 및 세포의 형태학적 특징이 조사되었고, ITS 와 LSU rDNA 영역의 염기서열을 분석하였다. 한국에서 분리된 H. cf. pygmaea 는 형태적으로 H. pygmaea 와 구분될 수 없었으나 유전적으로 차이를 보여 H. pygmaea 종복합체 내의 은밀다양성 (Cryptic diversity) 을 나타내었다. LSU 와 ITS 영역의 분자계통수에서 H. pygmaea 종복합체 내의 세 가지 리보타입 (A, B, C) 과 H. bohaiensis 가 하나의 분기군을 형성하였다. H. pygmaea 종복합체 내의 각 리보타입의 염기서열들은 뚜렷한 지리적 구분을 보였고 리보타입 간의 ITS 염기서열을 기반으로 한 유전적 거리에서 종간의 유전적 거리를 나타내었다. 또한 ITS2 2차 구조분석에서 모든 리보타입 간의 하나 이상의 CBC 를 보였다. 위와 같은 결과는 H. pygmaea 종복합체의 리보타입 간에 형태적으로 구분할 수 없는 종 분화가 일어났음을 시사하였다.