양식 넙치, Paralichthys olivaceus 에서 분리된 Streptococcus iniae의 특성 및 백신에 관한 연구

Abstract

본 연구는 제주도, 완도, 경남지역의 넙치 양식장에서 안구돌출·백탁·출혈, 복부팽만, 탈장, 하악부 출혈 등의 주증상을 나타내며 폐사하는 넙치를 대상으로 정확한 질병 원인을 밝히고자 하였으며, 분리된 병원체의 분자생물학적, 생리학적, 생화학적 특성을 관찰하여 이 질병을 예방하기 위한 토대를 마련하고자 하였다. 1. 연쇄구균의 분리 및 동정 우리 나라 양식넙치에서 안구돌출·백탁·출혈, 복부팽만, 탈장, 하악부 출혈 등의 주증상을 나타내며 폐사를 일으키는 연쇄구균병의 원인균은 S. iniae로 동정되었다. 이 동정을 위하여 S. iniae의 16S-23S rRNA ISR specific primer를 제작하여 PCR 분석으로 108 bp의 증폭산물이 검출되었고, 다른 종간의 검출에서도 특이적으로 진단할 수 있었다. S. iniae는 혈청학적 응집반응에서 응집반응이 강하고 L. garvieae KG＋ phenotype과도 교차응집반응을 보였다. β-용혈성인 S. iniae는 cell wall 표면에 capsule-like material이 존재하지 않았으며, ADH와 ribose 성상시험에서 모두 양성으로 나타난 serotype Ⅰ에 속하고, type A (β-glucuronidase positive) 및 RAPD pattern에서 3가지 pattern을 나타내었다. 2. β-용혈성 S. iniae JSL0208 균주의 인위감염 특성 β-용혈성 S. iniae JSL0208 균주의 인위감염시 외부증상 및 내부증상이 자연감염과 동일한 병원성을 나타났으며, 특이 증상으로 안구의 수정체에 기포가 형성되는 초기 증상을 보였는데 이것이 안구백탁 및 돌출의 원인으로 추정되었다. 또한, 에드워드병의 주증상인 탈장이 연쇄구균병에서도 나타났다. 인위감염의 복강주사에 의한 병원성 시험에서 β-용혈성 S. iniae JSL0208 균주에 의한 폐사율이 S. iniae JSL17 균주에 의한 폐사율보다 높게 나타났으며, 침지에 의한 병원성 시험에서 폐사는 주사 투여에 의한 폐사보다 늦게 나타났다. 인위감염에 의한 넙치의 장기별 세균수의 경시적 변화에서, 주사 투여 시험구는 3시간째 모든 장기에서 세균수가 감소하였고, 이 후 증가하여 48시간째 접종농도와 같은 균수가 장기에 나타났으며 이는 2일째 폐사가 일어나는 시기와 동일하였다. 침지투여 시험구의 경우 넙치의 장기 균수는 3시간째 급감하였고 특히 혈액에서는 검출되지 않았으며 이 후 48시간째 간, 비장, 신장에서 103～104 CFU/g를 나타내었고, 혈액에서는 96시간째 나타났다. 3. 포르말린 불활화 β-용혈성 S. iniae JSL0208 백신의 면역반응 넙치에 대한 β-용혈성 S. iniae JSL0208 백신의 효능을 조사한 결과, 포르말린 불활화 농도인 0.3% 및 3% 제조 백신은 복강주사시 어떠한 심각한 부작용도 야기하지 않았다. 또한 1회 접종구에 비해 2회 접종구에서 응집항체가가 유의적으로 증가하였으며, 포르말린 농도별로 비교한 결과 저농도인 0.3%에 비해 고농도인 3% 포르말린 처리 백신을 접종한 경우 1회 접종구에서는 4주째에, 2회 접종구에서는 8주째 응집항체가가 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 항체 생성에서 나타난 차이에도 불구하고 두 종류의 백신 모두 공격 실험 결과 방어력이 인정되었다.

Since 2000, streptococcal infections have been considered as a serious problem because of significant economic losses in marine fish farm industry, especially in oliver flounder (Paralichthys olivaceus). The causative bacteria was isolated from oliver flounder at Jeju, Wando, Ulsan and Busan. In this study, I described the isolation and identification of bacterial agent and investigated the microbiological properties and vaccine effects. Achieved results were summarized as follows: 1. Isolation and identification of the Streptococcus iniae Thirty cases of S. iniae were isolated from oliver flounder, Paralichthys olivaceus farms in 4 different cities in Korea. The flounder farms were suffering from the streptococcal infection with typical symptoms including darkening of skin, exophthalmia and opacity in the eyes, haemorrhages on the opercula, distened abdomen. The isolates were identified Streptococcus iniae by PCR assay with specific primers of 16S-23S rRNA ISR. The 108 bp PCR amplified product was detected in all the isolates by colony PCR assay. 2. Microbiological properties of the Streptococcus iniae S. iniae isolates were grown well at 20℃ and 37℃ but not at 45℃ and were grown in the 4% NaCl concentration but not in the 40% bile. In the biochemical test, S. iniae isolates were showed same characters as S. iniae KCTC3657 except for the acidification of arabinose and xylose. S. iniae isolates and S. iniae KCTC3657 showed β-hemolysis. In the serological analysis, the antiserum of S. iniae JSL0208(serotype Ⅰ) showed cross-reaction against the FKC of L. garvieae (KG＋ phenotype) and precipitated immediately S. iniae isolates on the slide agglutination test. Two distinct serotypes of S. iniae which were differ biochemically in their ability to react with arginine dihydrolase (ADH) and ribose have been recognized. Serotype Ⅰ was ADH and ribose positive which serotype Ⅱ was negative for both of these tests. All S. iniae isolates from oliver flounder revealed serotype Ⅰ and the capsule structure on the cell wall was not observed. Of the 30 S. iniae isolates from oliver flounder can be grouped in two types by the differences of β-glucuronidase. Twenty six isolates were type A (β-glucuronidase positive) and four isolates were type B (β-glucuronidase negative) of by enzymatic pattern. Using the BoxA primer, there were three banding patterns noted on the agarose gel. The enzymatic type A of twenty six isolates had the same DNA banding pattern. The strain patterns of the same serotype was distinguished by using enzyme reaction and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) technique. In the artificial infection test of S. iniae JSL0208 to the oliver flounder, S. iniae JSL0208 induced the fish with typical external and internal symptoms including hemorrhages, opacity and exophthalmia in the eyes, hemorrhage in the opercula, distended abdomen, protruded anus, and dropsy, enlarged kidney and spleen. 3. Vaccine efficacy of the Streptococcus iniae When the efficacies of S. iniae JSL0208 vaccines were tested on the olive flounder, Paralichthys olivaceus, no significant side effects were found. The antibody titers of booster immunized groups were significantly higher than those of prime immunized groups. According to formalin dosage, antibody titers of 3% formalin-killed cells (FKC) and 0.3% FKC injected groups were significantly increased. Antibody titers of 0.3% FKC booster vaccinated groups were reached maximum at 4 weeks after injection. Antibody titers of 3% FKC prime and booster vaccinated groups were reached maximum at 8 weeks after injection. Although the different levels of antibody production were showed by the vaccinated fish, the good protection obtained in challenge trials of the both vaccines. Relative percent survival (RPS) of the fish immunized with 0.3% FKC prime and booster injection were 66.7% and 87.5%, respectively while the fish immunized with 3% FKC were 70.0% and 77.0%, respectively.