Sulfation and Characterization of Polysaccharides from Oyster Mushroom (Pleurotus ostreatus) Extracted Using Subcritical Water

Abstract

느타리버섯으로도 알려진 Pleurotus ostreatus은 세계에서 가장 많이 소비되는 버섯 중 하나이다. P. ostreatus는 잠재적인 생물 활성과 건강 증진 특성을 지닌 훌륭한 다당류 공급원이다. 본 연구에서는 느타리버섯을 20°C 간격으로 120°C에서 200°C까지 아임계 수 추출(SWE)을 이용하여 다당류를 획득하였다. 해당 조건에서 획득된 고분자 추출물 중 다당류의 양이 가장 많은 추출 조건을 선택하여, 화학적 변형에 이용되었다. 결과로 180°C의 SWE에서 가장 높은 다당류의 수율을 얻었다. 선택된 조건에서의 다당류는 에탄올을 사용하여 정제되고 Chlorosulfonic acid (CSA) – Pyridine 방법을 사용하여 황산화 유도체화되었다. 황-다당류의 황 함량은 원소 분석기를 사용하여 분석되었으며 황산화 유도체화 정도는 1.83이었다. 천연 다당류(PN)와 황-다당류(PS) 간의 차이의 특성화는 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 핵자기공명(NMR), 겔투과 크로마토그래피(GPC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정되었다. FTIR의 1233, 1379 cm-1의파장에서는 S=O 비대칭 스트레칭 진동이 특징이며 해당 실험결과 해당 파장에서 강한 피크를 나타내는 것으로 보아 황산화 유도체화의 성공을 확인했다. 또한 796 cm-1에서의 흡수 피크는 일반적으로 C-O-S 대칭 스트레칭 진동을 나타낸다. 다당류의 분자량은 PN이 217,000Da, PS 146,000Da으로 황산화 유도체화 후 분자량이 감소 한것을 확인하였다. 시험관 내, 항 응고 실험은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 및 프로트롬빈 시간 (PT) 방법을 이용하여 평가하였으며, PS가 PN에 비해 내재 및 외인성 경로에 의한 혈장 응고 억제를 유의하게 개선했음을 보여주었다. PS의 농도를 15.62㎍/㎥으로 설정 후 항 응고 실험을 진행하여 내재 혈액 응고 경로에 의한 항 응고 활성평가 결과 공 실험에 비해 응고 시간이 3배이상 증가하였다. 항 산화 활성 실험 결과 PS는 환원력 억제 효과 및 수산화기 활성 라디칼에 대한 강력한 소거능을 나타내었다. 그러나 ABTS+ 라디칼 소거능에서는 PS가 PN에 비하여 더 약한 활성을 보였다. 또한 PN과 PS는 정상 세포에서 낮은 수준의 세포독성을 보였으며, HaCaT 및 HEK 293의 세포를 이용한 IC50은 순서대로 각각 약 1463.6, 1401.7 및 1116.5, 603.9µg/mL이다. 결론적으로, 황화는 느타리버섯 천연 다당류의 생물학적 특성을 향상시켰다. 아임계 수 추출을 통해 얻은 느타리버섯 다당류는 황산화 유도체화를 통해 항응고제 활성이 향상 될 수 있음을 나타낸다. 따라서, P. ostreatus의 황-다당류는 항응고제의 대체물질로 간주될 수 있다.

Pleurotus ostreatus also known as oyster mushroom is one of the most consumed mushroom in the world. They are a great source of polysaccharides with potential bioactivities and health-promoting properties. In this study, polysaccharides from oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus) were subjected to subcritical water extraction (SWE) from 120°C to 200°C with an interval of 20°C. Polysaccharides with the highest amount of polymer obtained at these conditions were selected for chemical modification. Results showed that SWE at 180°C recovered the highest yield of polysaccharides. The yield of selected condition were purified using ethanol and further sulfation with Chlorosulfonic acid (CSA) – Pyridine method. The sulfur content of modified polysaccharides was analysed using an elemental analyzer and the degree of substitution result was 1.83. Characterization of the differences between native polysaccharides (PN) and sulfated polysaccharides (PS) were determined by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), gel permeation chromatography (GPC) and high performance liquid chromatography (HPLC). FTIR results confirmed the success of chemical modification with the intensive peaks at a wavelength of 1233 cm−1 and 1379 cm-1 were characteristic for S=O asymmetry stretching vibrations. Another clear absorption peak at 796 cm−1 is typically for C-O-S symmetry stretching vibration. The molecular weight of polysaccharides decreased after the modification whereas PN ~217,000 Da and PS ~145,000 Da. In vitro anticoagulant activity using activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time (PT) assays showed that PS significantly improved plasma clot form inhibition by intrinsic and extrinsic pathways compared to PN. Sulfated polysaccharides showed surprisingly strong anticoagulant activity by intrinsic blood coagulation pathways as they extended the plasma clotting time more than 3 times at a concentration of 15.62 µg/mL as compared with the blank. Besides, PS exhibited strong scavenging effects against reducing power and hydroxyl free radicals in antioxidant capacities. However, they showed a weaker effect on ABTS+ scavenging activity compared to the PN. Moreover, PN and PS showed a low level of cytotoxicity on normal cells, including HaCaT and HEK 293 with IC50 approximately 1463.6, 1401.7 and 1116.5, 603.9 µg/mL, respectively. In conclusion, chemical modification enhanced the biological properties of oyster mushroom natural polysaccharides. Therefore, oyster mushroom polysaccharides obtained from subcritical water extraction and modified using the sulfation method showed great anticoagulant activity. P. ostreatus sulfated polysaccharides could be considered as an alternative to an anticoagulant agent.