Collagen-binding domain(CBD)과 융합된 재조합 Epidermal growth factor(EGF) 유전자의 발현 및 가용화 조건의 개발

Abstract

이전의 연구 과정에서, human epidermal growth factor와 collagen-binding domain이 결합된 융합단백질을 E. coli와 pET system을 이용하여 생산하였다. 하지만 E. coli에서 생산된 재조합 융합 단백질은 cytoplasm에서 발현되어 insoluble한 aggregate 형태의 inclusion body로 존재함을 알 수 있었다. 따라서 재조합 단백질을 active form의 형태로 분리하기 위해서는 적절한 denaturation 및 dialysis과정을 통하여 inclusion body의 solubilization 및 refloding이 매우 중요하다. 본 연구에서는 다양한 chemical agent와 buffer 조건을 달리하여 목적 단백질의 induction, solubilization, 그리고 dialysis를 통한 refolding을 수행하였다. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)와 같은 inducer 대신에 lactose와 skim milk를 이용하여 융합단백질의 overexpression 유무를 실험하였으며, 그 결과 lactose를 이용하여 성공적으로 expression을 유도할 수 있었다. 이렇게 발현된 inclusion body의 solubilization을 위하여 pH 및 다양한 농도의 chaotropic chemical agent를 이용하여 solubility를 측정하였다. 중성의 pH 보다는 알칼리성의 pH에서 inclusion body의 solubility가 더욱 높았으며, guanidine hydrochloride(Gn-HCl)보다는 urea를 이용한 denaturation 과정이 solubility가 높았다. Denaturation 과정으로써 soluble한 형태의 inclusion body의 refolding을 위한 dialysis buffer로는 20mM Tris-HCl (pH 8.0)이 효과적 이였다.