Cloning and characterization of ADP-ribosylation factors (ARFs) from Olive flounder (Paralichthys oliveceus)

Abstract

ADP-ribosylation factor(ARF)는 Ras superfamily에 속해있는 GTP-binding protein중 하나로, Phospholipas D의 활성화에 필요한 2차 전달자 역할을 한다. Phospholipase D는 phosphatidylcholine (PC)의 가수분해를 촉진하여 choline과 phosphatidic acid (PA)를 방출하며 세포증식, 분비, 호흡폭발을 일으키는 수용체의 신호전달 과정에서 중요한 역할을 하는 유전자이다. 또한, ARF는 세포 내 소포 수송과 엑틴의 리모델링의 기능을 가지고 있다. ARF는 3가지의 class로 구별되는데 본 연구에서는 넙치(Paralichthys olivaceus)의 cDNA library 구축 후, PoARF1, 3, 4, 6을 클로닝하여 cDNA full sequence를 밝혀냈다. 그 결과 PoARF1, 3, 4, 6 (PoARFs)의 open reading frame은 각각 PoARF1 (546bp), PoARF3 (546bp), PoARF4 (540bp), PoARF6 (528bp)의 길이를 가지고, 이것은 PoARF1 (182개), PoARF3 (182개), PoARF4 (180개), PoARF6 (176개)의 아미노산으로 번역되고 그 무게는 약 20kDa 으로 확인되었다. 아미노산 서열을 비교한 결과 다른 어종 및 포유류의 ARF들과 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하였다. PoARFs의 조직별 발현양상을 RT-PCR과 real-time PCR(qPCR)로 분석한 결과 PoARF1은 심장, PoARF3은 뇌, PoARF4는 아가미, PoARF6는 비장에서 발현량이 가장 높은 것을 확인하였고, 공통적으로 ARF네 가지 모두 근육에서 발현량이 가장 낮은 것을 확인하였다. 면역세포들과의 연관성을 확인하기 위하여LPS, Con A/PMA, Poly I:C를 넙치에 자극하였고, 염증 사이토카인 IL-1b와 IL-6 및 Mx gene을 면역자극지표로 사용, qRT-PCR를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 면역자극물질과 조직에 따른 발현량의 변화는 PoARFs의 종류마다 달랐지만 공통적으로 LPS자극 후, 근육의 1-6h 시간에서 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 넙치의 PLD1A와 1B(PoPLD1A, 1B)의 패턴과 일치하는 것을 확인하였고, 이것은 ARF가 PLD의 면역반응을 매개한다는 기존의 연구와 일치하였다. PoARFs는 pGEX 4T-1 vector에 삽입하여 E. coli에서 발현시켰고, 재조합PoPLD1B 단백질 활성과의 상관관계를 확인한 결과 PoARFs의 존재 하에서 PC-hydrolyzing activity가 증가하였다.