Cloning and characterization of Phospholipase D1B from Olive flounder (paralichthys olivaceus)

Abstract

Phospholipase D는 phosphatidylcholine (PC)의 가수분해를 촉진하여 choline과 phosphatidic acid (PA)를 방출하며 세포증식, 분비, 호흡폭발을 일으키는 수용체의 신호전달 과정에서 중요한 역할을 한다. 포유류 조직과 여러 가지 cell lines을 포함하여 다양한 원핵생물과 진핵생물에 존재하며 염증, 당뇨, 신경 및 심장자극과 같은 질병에서도 효소로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 넙치로부터 새로운 duplicated phospholipase D1 (PoPLD1B)를 encoding하는 cDNA의 full sequence를 밝혀내었다. PoPLD1B의 cDNA는 넙치의 여러 조직으로부터 얻었고, 5’ 과 3’ RACE로 완성 되어졌다. PoPLD1B의 전체 길이는 4958 bp로써, 시작 코돈 ATG부터 종결 코돈 TAA까지 3117b bp의 길이를 가지며, 5’ –70 bp와 3’-1771 bp의 UTR을 가진다. 또한 PoPLD1B는 1039개의 아미노산을 가지며, 약 167kDa의 크기로 확인되었다. 염기서열과 아미노산 서열을 비교한 결과 포유류 및 다른 어종의 PLD1과 높은 상동성을 나타내었다. Phylogenetic tree와 서열분석을 통해, 다른 PLD와 비교한 결과, PoPLD1B는 PLD1 isozyme과 모든 구조적 특성을 공유하고 있었다. PoPLD1B의 조직 발현량을 qRT-PCR로 분석한 결과, 아가미, 식도, 유문수, 위, 뇌, 장에서 높은 발현량을 나타내었다. 면역세포들과의 연관성을 보기 위하여 LPS, ConA/PMA, Poly I:C를 넙치에 자극하였고, 염증 사이토카인 IL-1b와 IL-6 및 Mx gene과 비교하여 qRT-PCR를 통해 분석하였다. 아가미에 경우, LPS과 ConA/PMA를 자극하였을 때 1-3시간에서 발현량이 7배 증가하였고, Poly I:C 자극 후에는 1-6시간에서 10배 증가하였다. 이러한 결과는 병원체 및 염증에 있어 어류의 PLD1B가 면역반응에 관여한다는 간접적인 증거를 제시한다. PoPLD1B는 pCold TF DNA vector에 삽입되어 E. coli에서 발현되었고, ADP-ribosylation factor 1 (ARF1)의 존재 하에서 PC-hydrolyzing activity를 나타내었다.