Comparison of molecular analysis and enzymatic characterization of phospholipase C-δ3A and C-δ3B from olive flounder (Paralichthys olivaceus)

Abstract

인지질가수분해효소 C-δ3 (PLC-δ3)는 원형질막에 존재하며, PIP2를 가수분해하여 2차 전령체인 IP3와 DAG를 생성한다. 이 유전자가 연관된 super-pathway는 신호 전달 활성과 칼슘 이온 binding을 포함한다. 선행연구로부터 넙치에서 PLC-δ1, PLC-δ4 및 PLC-δ3의 유전자를 동정하였고, 어류 특이적 게놈 중복을 통해 PLC-δ1와 PLC-δ3가 각각 두 가지 형태로 존재한다는 것을 밝혀내, PLC-δ3의 경우 이를 PoPLC-δ3A와 PoPLC-δ3B라고 명명하였다. PoPLC-δ3A의 cDNA 는 총3,816bp 로 구성되어 있고, 787개의 아미노산으로 번역되는 ORF는 2,361 bp이다. PoPLC-δ3B의 cDNA는 2,868 bp로 구성되어 있으며, 792개의 아미노산으로 번역되는 ORF는 2,376 bp이다. 두 유전자의 번역된 아미노산 서열은 서로 67.8%의 유사성을 가지고 있으며, 포유류에서 발견되는 모든 조절적 도메인들이 잘 보존되어 있음을 밝혀냈다. RT-PCR 및 real-time PCR을 통해, 두 유전자가 공통적으로 근신경계의 조직에 주로 발현하고 있으며, 면역과의 상관관계를 규명하기 위해 넙치의 외부로부터 LPS 및 Con A/PMA를 처리한 결과, PoPLC-δ3A 후기 면역에 대해 연관성이 있으며, PoPLC-δ3B가 정상상태의 넙치에서 비장에 많이 분포하므로 초기면역 대해서는 PoPLC-δ3B가 관여한다고 추측하였다. 두 유전자에 대해 효소학적 특성을 알아보기 위해 대장균에서 재조합 단백질을 만드는데 성공하였으나, PoPLC-δ3A는 기질에 대해 활성을 나타내지 않았고, PoPLC-δ3B만 활성을 나타내었다. PoPLC-δ3B는 pH 7.5, 10-2 M의 칼슘 이온 버퍼에서 최적 활성을 나타내었고, PLC-δ의 저해제에 대해 약한 감수성을 보였으며, 각종 활성인자들에 대해 다른 종의 PLC-δ와 유사한 활성 변화를 보여주었다. PoPLC-δ3B의 재조합 단백질은 기존에 PLC-δ의 주요 기질로 알려진 PI(4,5)P2외에 PS, PI(5)2 등에 높은 감수성을 나타내었다. PoPLC-δ3A가 활성을 가지지 못한 것에 대해, PoPLC-δ3A가 non-processed pseudo gene으로 존재하거나 PoPLC-δ3B보다 더 극적인 조건하에 활성을 가질 것이라는 가설을 세웠다. 이 연구는 최초로 해양생물 유래의PLC-δ3에 대해 특성분석을 하였으며, 세포 신호전달에 관련해 분자생물학적 기초자료를 제공한다.

The gene of phospholipase C-δ3 (PLC-δ3) encodes one of phospholipase C group which localizes to plasma membrane and catalyzes hydrolysis of phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) to produce second messengers, inositol 1,4,5-thriphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). Super-pathways related to this gene include signal transducer activity and calcium ion binding. In order to compare molecular characterization of Paralichthys olivaceus PLC-δ3, we identified duplicated PLC-δ3 genes, PLC-δ3A and PLC-δ3B, in olive flounder (P. olivaceus) from the previous studies. Similarity of amino acid sequence in two paralogous genes is 67.8% and regulatory domains discovered in mammalian PLC-δ are identically conserved in P. olivaceus PLC-δ3 isoforms. After performing RT-PCR and real-time PCR, we found out that the distribution of the tissue-specific expression and immune response by stimulation considerably varied in P. olivaceus PLC-δ3 isoforms. Although the recombinant proteins of PoPLC-δ3 isoforms were expressed with histidine-tag in Escherichia coli, PoPLC-δ3B only showed the activity at pH 7.5 and high concentration of calcium ion. From the further PIP2 hydrolyzing assay, we determined that the activity of PoPLC-δ3B was weakly inhibited by PLC inhibitor (U-73122) and strikingly regulated by spermine, spermidine and sphingosine. Moreover, PoPLC-δ3B has binding properties to phospholipid like mammalian PLC-δ. Regarding PLC-δ3 in aquatic organism, these results firstly provide the fundamental information of cellular signaling of PLC-δ3B and the possibility that PoPLC-δ3A has non-activity form in vitro or exists as non-processed pseudo gene.