Enterococcus faecalis에 대한 감태의 항균 및 시너지 효과

Abstract

Enterococcus faecalis는 주로 인간이나 포유류 등의 장에서 서식하는 통성혐기성 Gram 양성세균의 감염성 세균으로 질병은 periodontitis (치주염), urinary tract infection (요로감염증), wound infection (상처감염), abscesses (농양) 등이 있으며 심할 경우 bacteremia (균혈증), sepsis (폐혈증) 까지 일으킬 수 있는 병원성 세균이다. 또한 E. faecalis는 carbohydrates, glycerol, lactate, malate, citrate, arginine, agmatine 및 keto- acids 등 다양한 에너지원을 대사하고 강 알칼리(pH 9.6) 및 고염 등의 조건에서도 생육이 가능하며 최적생육범위는 10℃에서 45℃이나 60℃에서도 30분 정도 생존이 가능하다고 보고 되고 있다. 이러한 특성이 기인하여 최근 보건위생에서 심각한 문제로 대두되고 있는 것은 항생제 내성 Enterococcus spp. 세균의 증가로 이들은 aminoglycosides, penicillin, tetracycline, chloramphenicol, vancomycin 등의 항생제에 높은 수준의 내성을 나타내며 또한 두 가지 이상의 항생제에 대한 내성을 가지고 있는 다제내성균 (multiple drug resistance bacteria) 도 보고되고 있다 (Johnston and Jaykus, 2004; Hollenbeck and Rice, 2012). 특히, 문제가 되고 있는 것은 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 의 치료를 위해 사용된 vancomycin 에 대한 내성을 획득한 vancomycin resistant Enterococcus (VRE) 의 출현빈도 증가이다. 항생제 내성균의 출현빈도 증가는 Enterococcus spp.의 환경적응력의 영향도 있겠지만 주 원인은 항생제의 남용에서 찾을 수 있다. 따라서 이번 연구에서는 대체 항생제의 개발이 아닌 천연 추출물의 생리활성물질을 통해 균을 억제할 수 있는 방법에 관한 연구를 진행하기로 하였고, 생체에 대한 안정성이 높고 부작용이 적은 생리활성 물질 또는 의약품으로 많이 검토 되어진 육상생물에서 벗어나 다양한 생리활성물질을 존재한다고 밝혀지고 있는 해양생물자원 중 해조류 추출물의 항균활성에 대하여 연구하였다. 갈조류, 녹조류, 홍조류를 포함 한 총 15종의 해조류 MeOH 추출물의 항균활성을 표준균주 및 병원체 분리균주를 대상으로 disc diffusion assay를 통해 검토하였으며 이 중 가장 항균활성이 좋았던 감태 추출물을 시험대상으로 선정하였다. 선정 된 감태를 5종의 용매 (Hexane, DCM, EtOAc, BuOH, H2O) 로 분획 및 추출하여 disc diffusion assay법을 이용하여 항균활성을 평가하였다. 그 결과 EtOAc 분획 추출물이 E. faecalis 균주에 대해 10.5mm~12.5mm의 clear zone을 형성하는 것으로 나타났으며, 이는 감태 MeOH 추출물이 다른 해조류보다 E. faecalis에 대한 항균물질을 보다 많이 함유하고 있다는 것을 의미하였다. 또한 정량적인 평가인 MIC 및 MBC test를 진행한 결과 128 µg/mL의 농도로 표준균주인 E. faecalis KCTC 3206과 7종의 분리균주 (P 107, P 132, P 227, P 684, P 690,P 1499, P 2088) 의 성장을 완전히 억제하는 것을 알 수 있었으며 감태의 EtOAc 추출물은 세균의 최소살균농도를 평가하는 MBC test에서도 MIC value보다 2배를 초과하지 않는 농도 (모든 균 256 µg/mL) 로 세균의 최초 접종 균 수로부터 99.99% 살균이 가능함을 나타내었다. 선행연구 결과를 바탕으로 항생제 내성균의 출현을 억제하기 위한 alternative therapeutic method 로서 항균활성을 나타내는 천연물과 항생제 내성균에 대한 효력을 잃어버린 항생제와의 병용을 통해 잃어버린 항생제의 항균활성회복에 관해 검토하였다. 본 연구에서는 disc diffusion assay와 MIC assay를 통해 E. faecalis에 대한 강한 항균 효과를 가지고 감태의 EtOAC 분획 추출물과 항생제간의 병용에 의한 antibacterial synergy effect 에 대한 연구를 진행하였으며 시험에 이용 된 항생제는 상업적으로 이용되는 10종의 항생제를 선택하였고 실험은 BBL™ Sensi-Disc™ Susceptibility Test Discs (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) 를 사용하여 실시하였다. 시험결과 표준균주인 E. faecalis KCTC 3206와 분리균주인 E. faecalis isolated P690 및 P1499을 제외한 나머지 분리균주에서 ciprofloxacin과 gentamicin 에 대한 생육 저지환 (clear zone)이 나타나지 않았다 (Table 6). 분리균주인 E. faecalis isolated P1499는 ciprofloxacin 에서만 clear zone이 나타나지 않았다. 이 결과는 5종의 분리균주의 경우, ciprofloxacin과 gentamicin에 대한 내성을 가지고 있는 다제내성균 (multiple drug resistance bacteria) 이라는 것을 의미하였다. 이를 바탕으로 E. faecalis 군주들에 대한 두 항생제의 항균력을 MIC assay로 정량 분석한 결과 Ciprofloxacin은 표준균주인 KCTC 3206 균주에 적용 시 MIC 값이 0.0625 µg/mL로 다른 분리균주들의 경우는 4 ~ 8 µg/mL 로 분석되었다 (Table 7). 다섯 분리균주들 (P107, P227, P 684, P1499 및 P2088)의 ciprofloxacin에 대한 MIC 값은 항생제 내성의 기준값인 MIC breakpoint value 인 2 µg/mL 보다 모두 높은 값을 가지기 때문에 ciprofloxacin에 대한 항생제 내성을 획득했다고 판단된다 (Hällgren et al. 2011). 하지만 Gentamicin은 표쥰균주인 KCTC 3206 균주에 적용 시 MIC 값이 0.125 µg/mL로 다른 분리균주들의 경우는 2 ~ 64 µg/mL 로 분석되어 gentamicin 의 MIC breakpoint value 인 500~1,024 µg/mL 보다 모두 낮기 때문에 본 연구에서 사용된 분리균주들은 gentamicin 감수성 균주인 것으로 분석 되었다 (Hällgren et al., 2011; Table 7). 앞선 결과를 토대로 천연 추출물과 항생제를 병행사용 하였을 때 어떠한 상승작용이 나타나는지 확인하기 위해 FIC test를 진행하였다. ciprofloxacin은 감태 EtOAc 분획 추출물 (8 µg/mL)을 병용 사용하였을 때 0.5 µg/mL 의 ciprofloxacin 첨가에 E. faecalis 균주들의 증식을 억제할 수 있으며 결과적으로 ciprofloxacin 을 단독 사용하였을 때 보다 8~32배 낮은 농도로 E. faecalis균의 생육을 억제할 수 있는 것으로 분석 되었다 (P107, P227 및 P1499 균주의 경우 8 배; P684 균주의 경우 16배; P2088 균주의 경우 32배). 이러한 결과를 바탕으로 FIC value를 계산해 본 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 각각 0.188, 0.508 ~ 0.563 및 0.266 ~ 0.344로 나타났다 (Table 8). 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 모두 <1.0 이하의 값을 나타내었기 때문에 감태의 EtOAc 분획 추출물과 ciprofloxacin의 병용사용은 E. faecalis균에 대해 week synergy 효과가 나타나는 것으로 나타났다 gentamicin은 감태 EtOAc 분획 추출물 (8 µg/mL)을 병용 사용하였을 때 0.25 ~ 8 µg/mL 의 ciprofloxacin 첨가에 E. faecalis 균주들의 증식을 억제할 수 있었다. 결과적으로 gentamicin 을 단독 사용하였을 때 보다 모두 8배 낮은 농도로 E. faecalis균의 생육을 억제할 수 있는 것으로 분석 되었다. 이러한 결과를 바탕으로 FIC value를 계산해 본 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 각각 0.188, 0.258 ~ 0.563 및 0.175 ~ 0.354로 나타났다 (Table 9). 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 모두 <1.0 이하의 값을 나타내었기 때문에 감태의 EtOAc 분획 추출물과 ciprofloxacin의 병용사용은 E. faecalis균에 대해 week synergy 효과가 나타나는 것으로 나타났다. 하지만 앞서 기술한 바와 같이 gentamicin의 MIC 값이 MIC breakpoint value 인 500~1,024 µg/mL 보다 모두 낮기 때문에 본 연구에서 사용된 분리균주들은 gentamicin 감수성 균주인 것으로 판단되어 시험결과는 참고자료로 한정되어야 할 것이다. 본 연구 결과는 과거에 많이 검토 되었던 육상자원 유래의 생리활성물질에 관한 연구의 한계에서 벗어나 해양생물자원의 생리활성물질에 대한 검토로써 의미가 있으며 항생제가 아닌 천연물을 통해 주요 식중독 세균인 E. faecalis의 생육 억제뿐만 아니라 항생제 내성을 가지고 있는 multiple drug resistance E. faecalis 에 대한 효과적인 제어 방법으로 감태 유래 추출물을 기존의 항생제와 병용 사용함으로써 항생제 남용에 따른 항생제 내성균의 출현 억제뿐만 아니라 잠재적인 치료제로도 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 식품 공정에서 E. faecalis의 감염의 문제를 해결하는데 기여할 수 있을 것이라 생각되며 추후 정제과정 등을 거쳐 생리활성물질에 대해 더 심도 있는 연구를 진행하여 다양한 의약적 측면에서의 요구에 부응할 수 있을 것이라고 생각된다.