바위털갯지렁이, Marphysa sanguinea 유생 추출물의 요각류에 대한 방어효과

Abstract

바위털갯지렁이(Marphysa sanguinea) 대량종묘생산과정에서 해적생물의 포식에 의한 초기 생존율 저하가 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. Marphysa sanguinea 유생이 대량으로 분출된 수조에서는 해적생물이 유생 군집을 회피하는 현상이 관찰되었다. 이것은 초기 유생단계에서 방어물질(deterrent)을 분비하는 것으로 추정되었다. 따라서 바위털갯지렁이의 유생을 채집 및 분리, 추출, 정제하여 수중 해적생물의 구제 가능성을 검토하고자 한다. 바위털갯지렁이 유생은 부경대학교 수산과학기술센터 내에서 생산되는 유생을 자연종묘와 인공종묘를 사이펀(siphon)을 통해 채집하였다. 채집된 바위털갯지렁이 유생(1차, 117.5 g)을 Methanol(MeOH) 추출법으로 유생내의 물질을 추출하였다. MeOH로 추출한 유생 추출 농축물은 역상 칼럼(ODS-Q3) 으로 MeOH 농도별(70%, 85%, 100%) 분리를 하였다. 그 후 packed column(RPAQUEOUS)상에서 1차 분획, packed column(ODS SP100) 상에서 2, 3차 분획을 진행하였다. 이 과정은 2, 3차 유생 시료에서도 동일한 과정으로각각 진행하였다. 이 과정에서 각 단계별 추출 및 정제된 유생 방어물질의 요각류 치사성 시험을 위해 바위털갯지렁이 사육수조 및 치충 사육수조 내의 요각류를 채집하여 멸균해수를 대조구로하고 역상 칼럼(ODS-Q3)과 packed column(RPAQUEOUS, ODS SP100)상에서 분획된 각각의 획분을 실험구로 하는 요각류 치사성 시험를 실시하였다. 요각류 치사성 시험에서 요각류의 치사는 움직임이 없어질 때를 기준으로 하였다. Packed column(RPAQUEOUS)상에서의 획분 4th peak는 2, 3차 packed column(ODS SP100) 분획을 거치고, 최종 ‘4-4-6’은 약 70 ㏙의 농도에서 2시간이 경과하면서 반수치사량(LD50)을 넘어섰고, 7시간 경과 후에는 모든 개체의 활성이 없어진 것을 확인하였다. Packed column(RPAQUEOUS)상에서의 획분 5th peak는 2, 3차 packed column(ODS SP100) 분획을 거치고, 최종 ‘5-6-11’은 약 10, 20, 40 ㏙의 농도에서 2시간이 경과 후 반수치사량(LD50)을 넘어서는 것을 확인하였고, 3시간이 경과하면서 모든 요각류 개체의 활성이 없어지는 것을 확인하였다. 이상의 결과에서 요각류에 대한 치사성이 나타난 획분인 ‘4-4-6’ 및 ‘5-6-11’ 시료에 대한 질량분석 결과, ‘4-4-6’ 시료는 m/z 278에 ‘5-6-11’ 시료는 m/z 280에 각각 M+ 이온이 관측되어 분자량이 각각 278 및 280으로 추정되었다. 이들의 추정된 분자량으로부터 ‘4-4-6’은 불포화 지방의 일종으로 2중 결합을 3개 가진 linolenic acid(분자량 278, 분자식 C18H28O2)와 일치하였으며, ‘5-6-11’은 2중 결합이 2개인 linoleic acid(분자량 280, 분자식 C18H30O2)와 일치하였다. 또한, 이들의 fragment 이온들의 peak들을 linoleic acid 및 linolenic acid의 질량분석 spectrum과 비교한 결과, 이들도 잘 일치하여, 불순물이 들어 있기는 하지만 이들 지방산들이 주성분으로 되어 있으며, 이들이 요각류을 치사시키는 방어물질로 작용하는 것으로 추정되었다. 따라서 이 연구에서 확인된 바위털갯지렁이 유생의 방어물질은 친환경 고부가가치로 인정받고 있는 바위털갯지렁이의 대량종묘생산에 있어 해적생물의 효과적인 구제물질로써 이용될 가능성이 있을 것으로 판단되고, 초기 유생의 생존율향상에 크게 기여할 것으로 보인다.

In the seed production processes of M. sanguinea, the most important problem is the deterioration of survival rate by attacking upon predatory organisms. Predators such as copepod trend to disappear in the larvae producing tanks. It was estimated that larvae might be excreted some deterrents. Therefore, the study was conducted to increase survival rate of early larvae stage through investigate of defensive material from M. sanguinea larvae. Initially, approximately 2.5 million larvae were extracted with methanol(MeOH) and, consequently, separated by 70%, 85% and 100% MeOH using the ODS-Q3 column (1×20 ㎝). The purified experiment had been conducted by using a chromatographed RPAQUEOUS column(1×25 ㎝, 40℃, 221 ㎚, 90% MeOH, 1 ㎖/min) through HPLC system. Moreover, the copepod lethality tests were conducted at each peak groups and chromatographed on a ODS SP100 column(1×25 ㎝, 40℃, 221 ㎚, 90% MeOH, 1 ㎖/min) by the HPLC system. And then, the each peak(Experiment groups were lost on copepod lethality test)was purified on a ODS SP100 column(1×25 ㎝, 40℃, 221 ㎚, 80% MeOH, 1 ㎖/min) by the HPLC system. The results showed that‘4–4–6’ have lethal dose 50 on 70 ppm after 2 hours. And‘5–6–11’have lethal dose 50 on 10, 20, 40 ppm after 2 hours. M+ ions of ‘4–4–6’and‘5–6–11’were m/z 278, m/z 280 with 278 & 280 in molecular weight, respectively, in mass spectrometry. From these results, Linolenic Acid (278 MW, C18H28O2)andLinoleicAcid(280MW, C18H30O2)were identified. In the other hand, their main components were fatty acids. In conclusion, defensive materials of M. sanguinea larvae are estimated in fatty acids and their activities can enhance the overall survival rate of larvae.