참굴의 종보존을 위한 번식생리 및 유생 냉동보존

Abstract

요 약 본 연구에서는 냉동·해동 후 유생사육에서 성공적인 치패생산을 하기 위한 참굴의 번식생물학적 기초자료를 얻고자 하였다. 따라서 모패의 번식생리 활성, 난발생 및 부화유생의 섭식활성을 통해 이로부터 얻어진 양질의 알과 발생배를 이용하여 적정 결빙억제제(cryoprotectant agent, CPA)를 탐색하였고 냉동·해동 후 사육실험을 통한 발생 진행 및 보존기간을 파악하였다.

번식생리 본 연구에서는 냉동보존용 우량한 알과 정자를 얻기위한 모패의 번식생리활성을 파악하고자 비만도와 생식소 발달과정, 번식주기 및 산소소비 활성을 조사하였다. 비만도는 2012년 4월 0.13이던 것이 5월, 6월에 각 0.12로 감소하였으며, 7월, 8월에 0.08, 0.07로 감소하였다. 이 후 10월, 11월에 가장 낮은 0.05을 보였다. 이 후 2013년 3월까지 큰 변화를 보이지 않았다. 월별 육중량비도 5월에 27.7%로 가장 높았으며, 10월에 14.7%로 가장 낮은 값을 보임으로써 비만도와 유사한 연주기를 나타내었다. 2012년 4월부터 2013년 3월까지 어미굴의 월별 생식소 발달단계를 알기 위하여 조직 표본하여 조사한 결과, 어미굴의 발달단계는 분열증식기 1월~3월, 성장기 3~5월, 성숙기 5~9월, 산란기 6~10월 그리고 휴지기는 9~1월 이었다.

산소소비 생리활성 수온이 높아질수록 산소소비량과 암모니아 배설량은 유의하게 증가하였다. 혈액성상에서 Na⁺ 및 Cl⁻ 농도는 25℃에서 유의하게 증가하였다. ALT 및 AST 농도는 15, 20℃에서 대조구와 유사하였으며, 25℃에서 증가하였다. 정상 및 기아시의 산소소비와 암모니아 배설량은 기아조건시 유의하게 낮아졌다. ALT 및 AST 농도는 기아시 유의하게 낮아졌다. 난발생 본 연구에서는 인공종묘 생산뿐만 아니라 냉동보존에 있어 적정 발생단계 유생을 정확한 시간대에 얻고 산란유발을 통해 적정 난발생 온도를 구명 하였다. 그리고 수온별 난발생 속도와 수온, 염분 및 수용밀도별 부화율을 조사하였고 기아일수에 따른 유생의 먹이섭식 능력에 관한 연구를 실시하였다. 참굴의 수정란은 분리침성란 이었으며, 수정후 난핵포가 소실되었고 이어서 제1극체가 방출되었다. 이후 난할이 계속 분할되면서 2세포, 4세포, 8세포, 16세포, 상실배를 거쳐 포배로 발달하였으며, 이때부터 섬모운동에 의한 회전운동이 관찰되었다. 포배는 부유생활을 하는 낭배기로 발달하였으며, 이어서 소화기관이 형성되는 담륜자, 면반과 D형의 유각이 형성되는 D형유생으로 발달하였다.

방란·방정 소요시간 및 반응률 신경전달물질인 serotonin 농도에 따라 방란·방정 소요시간을 조사한 결과, 방란 소요시간은 serotonin 농도 10⁻⁵, 10⁻⁴, 10⁻³, 10⁻² M에서 7.6~27분으로 나타났으며, 농도가 낮아짐에 따라 소요시간은 길었다. 방정시간 역시 농도가 낮아짐에 따라 소요시간은 길었다. 반응률은 serotonin 농도 10⁻⁵, 10⁻⁴, 10⁻³ 및 10⁻² M을 주사한 결과, 10⁻⁵M은 암컷, 수컷의 반응률은 각각 60%, 66.7%였으며, 10⁻⁴ M은 66.7%, 86.7%이고 10⁻³ M은 80%, 100%이며 10⁻² M에서는 86.7%, 100%로 나타나 농도가 높을수록 반응률 또한 높았다.

산란량 산란량을 조사한 결과, 10⁻⁵, 10⁻⁴, 10⁻³, 10⁻² M 및 대조구에서 한 개체당 산란량이 각각 100.76만, 147.21만, 150.32만, 266.44만 및 14.1만 개가 산란하였고, 10⁻² M 이 다른 농도에 비해 높은 산란량을 나타내였으며, 10⁻⁴, 10⁻³ M에서는 유의한 차이를 나타나지 않았다.

난핵포 붕괴율 방출 2시간 후 알의 대한 GVBD율을 조사한 결과, 각각 10⁻⁵, 10⁻⁴, 10⁻³ 및 10⁻² M 농도에 따라 86.5±2.3%, 85±2.9%, 88.1±4.5% 및 88.9±2.2%였다.

수정률 및 부화율 serotonin 농도에 따른 방출된 알과 정자의 수정률 및 부화율은 10⁻⁵, 10⁻⁴, 10⁻³ 및 10⁻² M에서 수정률은 각각 84.7%±1.4%, 83.1±1.7%, 84.3±1.7% 및 83.2±0.8%로 나타났다. 부화율에서는 73.1±1.3%, 76.5±0.8%, 74.6±1.9% 및 71.9±0.8%였다.

수온별 난발생 속도 15, 20 및 25℃에서는 수온이 높아질수록 각 발생단계까지의 소요시간은 짧아지는 경향을 나타내었고, 30℃에서도 소요시간은 짧았으나, D형유생으로 발생진행을 하지 못하였고 폐사하였다. 또한 온도가 낮을수록 발생속도는 느렸으나, 난분할 상태나 발생배의 외형은 정상적인 반면, 수온이 높을수록 발생배나 유생의 기형률이 높았다.

수온, 염분, 수용밀도별 부화율 수정률은 15℃에서 72.0±0.7%, 20℃에서 87.8±1.3%, 25℃에서 91.4±1.4%, 30℃에서는 82.8±1.6%였으며 부화율은 15℃에서 63.8±1.4%, 20℃에서 81.7±0.5%, 25℃에서 85.2±1.3%, 30℃에서는 63.8±1.3%였다. 그리고 D형유생 발생진행율에서는 15℃에서 52.4±0.3%, 20℃에서 72.2±1.3%, 25℃에서 78.7±0.9%였으나, 30℃에서 발생진행률은 0%였다. 염분에 따른 수정률은 20 psu에서 47.2±2.2%, 25 psu에서 82.6±1.0%, 30 psu에서 86.5±1.3%, 35 psu에서 89.8±1.3%, 40 psu에서는 11.8±1.1%였으며, 부화율은 20 psu에서 36.4±1.3%, 25 psu에서 73.5±1.4%, 30 psu에서 81.3±1.5%, 35 psu에서 83.7±1.0%, 40 psu에서는 0%였다. 그리고 D형유생 발생진행률에서는 20 psu에서 19.8±1.6%, 25 psu에서 62.9±1.7%, 30 psu에서 79.2±1.2%, 35 psu에서 80.4±0.9%였으나, 40 psu에서는 발생진행율은 0%였다. 유생밀도별에 따른 수정률은 100/mL에서 71.5±1.1%, 300/mL 에서 82.0±0.7%, 500/mL에서 83.6±0.6%, 1000/mL에서 84.1±1.8%, 2000/mL에서는 84.8±1.5%였으며, 부화율은 100/mL에서 66.9±1.8%, 300/mL 에서 77.8±0.7%, 500/mL에서 76.4±1.5%, 1000/mL에서 54.8±0.7%, 2000/mL에서는 43.6±2.0%였다. 그리고 D형유생 발생진행률에서는 100/mL에서 63.4±2.1%, 300/mL psu에서 72.3±0.3%, 500/mL에서 72.5±1.0%, 1000/mL에서 37.8±0.6%, 2000/mL에서는 23.8±0.9%으로 나타냈다.

CPA 농도 및 침투시간별 미수정란의 발생진행률 본 연구에서는 패류양식 산업에서 중요한 위치를 점유하고 있는 참굴의 미수정란 및 유생을 냉동보존 하기위한 적합한 CPA 농도 및 침투시간을 조사하였다. 미수정란은 EG 10% 침투시간 10분일 때 수정률 및 부화율이 높았다. 담륜자의 적정 CPA종류, 농도 및 평형시간을 조사한 결과, DMSO는 24, 26, 28%와 평형시간은 각각 90, 30, 15분 이였으며, EG는 26, 28%와 평형시간은 210, 120분으로 조사되었다. D형유생의 적정 CPA종류, 농도 및 평형시간을 조사한 결과, DMSO 22, 24, 26%와 평형시간 60, 60, 10분 이였으며, EG는 24, 26%와 평형시간 210, 90분으로 조사되었다.

냉동-해동-용출 후 미수정란과 유생의 발생진행 및 활성 본 연구에서는 유용종 양식 패류인 미수정란 및 유생을 이용하여 장기간 보존후 해동시 발생 및 성장에 관한 연구의 기초자료를 제공하기 위해 사육을 통한 유생의 발달단계 및 생존율을 파악하고자 실험을 실시하였다. 냉동속도별 해동-용출 유생의 생존율 및 유생활성지수는 담륜자 유생을 이용하여 0.2 M sucrose와 CPA로는 DMSO 24, 26, 28%, EG 26, 28% 및 2.0 M를 사용한 결과, 냉동·해동후 생존율은 DMSO 24%, 26%일 때 각각 18.5±0.3%, 3.9±0.1%였으며, LAI는 각각 2.5, 2.1로 나타내었다. EG는 26%일 때 11.4±0.3%, 2.0 M은 59.8±0.1%였으며, 2.0 M이 유의하게 높았다. LAI는 각각 2.0, 3.4로 나타났다. 그러나 냉동방법 Ⅱ, Ⅲ에서는 생존율이 나타나지 않았다. D형유생의 생존율은 DMSO 22, 24%일 때 각각 16.1±0.1%, 5.5±0.1%였으며, LAI는 2.0, 1.0으로 나타났다. EG에서는 24%, 2.0 M 일 때 각각 21.4±0.3%, 69.3±0.5%였으며, 2.0 M이 유의하게 높았다. LAI는 1.5, 2.4로 나타났다. 그러나 냉동방법 Ⅱ, Ⅲ에서는 생존율이 나타나지 않았다. 식빙유무에 따른 생존율은 식빙을 하였을 때 모든 실험구에서 생존율이 나타났다. 해동직후 담륜자 유생의 생존율은 87.5%로 시간이 경과함에 따라 생존율이 감소하였다. 31시간째 20.6%로 급격히 감소되고, 90시간째 모두 폐사하였다. 그러나 31시간째 형태이상인 D형이 2.9%가 관찰 되었으나, 더 이상의 발생진행률이 없이 폐사하였다. 해동직후 D형유생의 생존율은 73.2%였으며, 시간이 경과함에 따라 생존율은 서서히 감소하다, 25시간째 66.2%, 60시간째 12.4%, 108시간째 이르러 모두 폐사하였다.