Cryopreservation of gametophytic thalli of Ulva prolifera (Ulvales, Chlorophyta) from Korea

Abstract

동결보존은 오염과 유전적 변이를 발생시키지 않는 안전한 보존방법이다. 가시파래 종 보존을 위해서 전남 완도에서 생체표본이 채집되었고, 이로부터 배양주가 확립되었다. 종 동정은 형태 특징과 염기서열을 이용한 계통분석(NJ)을 통하여 이루어졌다. 그리고 동결보존한 가시파래 배우체의 생존율에 대한 동해방어제, 일차 동결 온도, 해동 온도, 액체질소에 보존한 기간의 영향이 조사되었다. 시료는 1℃/min⁻¹ 속도로 일차 완만 동결 후 액체질소에 급속 동결하는 2단계 냉각법으로 동결보존되었고 생존율은 엽체를 0.05% (w/v) erythrosine 시약으로 염색하여 Photoshop과 ImageJ 프로그램을 이용하여 산정되었다. 동해방어제는 혼합 동해방어제와 3종류의 동해방어제 [Dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, 그리고 proline]가 5가지 농도 (5%, 10%, 15%, 20%, 그리고 25%)로 사용되었다. 일반적으로 효과적이라고 알려진 혼합 동해방어제 뿐만 아니라 15-25% glycerol을 단독으로 사용했을 때도 생존율이 최대로 높게 산정되었다. 일차 동결 온도별 (-20℃, -30℃, -40℃, -50℃, 그리고 -60℃) 생존율은 -40℃와 -50℃에서 유의하게 높았고 해동 온도별 (0℃, 20℃, 40℃, 60℃, 그리고 80℃) 생존율은 40℃, 60℃, 그리고 80℃의 높은 온도에서 빠르게 해동할 때 유의하게 높았다. 장기간 보존된 가시파래 배우체의 생존율은 120일까지 통계적으로 유의한 차이 없이 91.2-92.1%로 매우 높았다. 120일 동안 동결보존한 엽체는 배양 4일 후 배우자 형성률이 95.7%에 도달했으며 방출된 배우자도 정상적인 배우체로 발달했다. 결론적으로 동결보존 동안 가시파래 배우체의 생존율은 동해방어제, 일차 동결 온도, 해동 온도의 영향을 받고 액체질소에 보존한 기간의 영향은 받지 않았다. 따라서 한국산 가시파래 배우체는 동해방어제로 15-25% glycerol을 단독으로 사용하거나 혼합 동해방어제를 사용하여 1℃/min⁻¹ 속도로 -40℃나 -50℃까지 일차 완만 동결 후 액체질소에 급속 동결하는 2단계 냉각법과 빠른 해동으로 장기간 성공적인 동결보존이 가능하다는 결론을 얻었다.