Differentially expressed genes associated with a growth of Pacific abalone, Haliotis discus hannai

Abstract

Pacific abalone (Haliotis discus hannai) is one of the commercially important marine gastropods in Korea aquaculture industry. In order to identify the gene associated with a faster growth of abalones, RNA was isolated from soft tissues of abalone’s spats for 200 days post-fertilization (dpf). Abalones were divided into three groups (small, medium and large) by size. Up to 20-fold variations in weights were noticed among small, medium, and large size groups ranging from 0.26±0.09 g, 1.43±0.405 g, and 24±1.09 g, respectively. RNA-Seq analysis was carried out to examine the transcriptome and differentially expressed genes associated with the faster growth. Transcript levels were quantified by RPKM values with 0.3 threshold value for differential expression. Based on transcriptome analysis and functional annotation, several transcripts were selected as candidates associated with faster growth in abalones. A transcript encoding vitelline envelope zona pellucida (ZP) domain 4 showed up-regulation in a larger size abalones. In order to examine its development stage-dependent expression, RT-PCR analysis are carried out with abalones collected from egg, 50, 100, 150 and 200 dpf. RT-PCR using specific primers to ZP domain 4 gene indicated its female-specific expression in large group abalones of 200 and 300 dpf. During the study, RNA isolation from hepatopancreas and gonad, in particular from the large size abalones, seemed to be challenging. The difficulty in the following RT-PCR might be due to the presence of inhibitory materials co-precipitated with RNA. An efficient and simple method was developed for extracting high quality RNA from pacific abalones without inhibitory materials.

참전복(Haliotis discus hannai) 은 양식 산업에서 중요한 해양 복족류 중 하나이다. 전복의 속성장과 연관된 유전자를 확인하기 위하여, 동일한 조건에서 200일 동안 자란 전복을 크기에 따라 small, medium 그리고 large group으로 나눴다. Small과 large group은 약 20 배 정도의 무게 차이를 보였으며 그룹별로 분류한 전복의 연조직으로부터 RNA를 추출하였다. RNA-Seq analysis을 시행하여 속성장과 연관된 전사체와 differentially expressed genes을 조사하였고, RPKM 값 0.3 이상의 전사체를 대상으로 목록을 구성하였다. 전사체 분석과 기능적인 annotation을 기반으로 하여, 몇몇의 전사체를 전복의 속성장과 연관된 후보로 선별하였다. 그 중 Vitelline envelope zona pellucida (ZP) domain 4을 암호화하는 전사체는 large 크기의 전복에서 up-regulation이 나타나는 것을 확인하였다. 속성장에 연관된 vitelline envelope ZP domain 4를 확인 하기 위하여 200일 그리고 300일의 두 그룹(small and large)과 발달 단계별 전복(egg, 50, 100, 150 그리고 200 일)으로부터 RNA 추출 후 RT-PCR 분석을 시행하였다. Vitelline envelope ZP domain 4 의 특이적인 primer를 사용하여 RT-PCR을 시행한 결과 200일과 300일의 large group의 전복 개체에서 주로 발현되는 것을 확인하였다. 조직별로는 암컷 생식소에 특이적으로 발현되며 적어도 200일은 자란 전복에서 나타난다는 것을 RT-PCR을 통해 확인하였다. RNA 추출 실험 결과, 성숙한 전복의 간췌장과 생식소로부터의 RNA 추출시료에 따라 RNA 수율과 RT-PCR 확인에 차이가 있음을 발견하였으며, 이는 RNA와 co-precipitated 하는 물질이 cDNA 과정을 저해하는 물질임을 증명하였다. 따라서, 참전복의 간췌장과 생식소에서 inhibitory material가 없이 RNA를 추출하기 위한 간단하고 효과적이며 신뢰성있는 방법을 개발하였다.