Purification and Characterization of Antimicrobial Peptides from Sea anemone, Urticina crassicornis

Abstract

본 연구에서는 민가죽해변말미잘(mottled anemone, Uriticina crassicornis)의 다섯 조직 추출물을 이용하여 항균활성, 항산화 활성, 그리고 용혈활성을 확인하였다. 말미잘 각각의 조직 추출물에 대한 항균 활성을 측정한 결과, 모든 조직의 추출물에서 실험에 사용된 그람 양성 및 음성균주 및 어병세균인 Aeromonas hydrophila에 대한 광범위한 항균 활성을 나타냈다. 추출물에 단백질분해효소인 트립신을 처리한 결과, 항균활성이 완전히 소실되었기 때문에 각 추출물의 항균활성에는 단백질성 물질이 주로 관여하고 있음을 추측할 수 있다. 아스코브산에 대한 상대적 항산화 활성을 측정한 결과, 내장 조직 추출물에서만 50% 정도의 항산화 활성이 측정되었고, 나머지 추출물에서는 활성이 미미하였다. 또한 민가죽해변말미잘의 모든 조직 추출물은 강한 항균활성을 나타내는 동시에 인간의 적혈구에 대하여 용혈 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 활성이 강한 인두(pharynx) 및 체강액(coelomic fluid) 추출물로부터 CAU-PAGE 및 RP-HPLC를 통해 다섯 개의 새로운 항균활성 펩타이드(UcTX-I, II, III, IV, V)를 정제하였다. 정제한 펩타이드의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과는 다음과 같다: UcTX-I (4314 Da), GASXDXHPFVGTYWFGISNXPSGHGYRKKXAXFFGV; UcTX-II (4194 Da), GGIPCSCKDESGIYWFGRY; UcTX-III (4385 Da), GASXDXHPFKGTYWFGTSNXPSGHGYRKKXDSFFXV; UcTX-IV (5197 Da), GIWDCQCSGDAPNKAWNDLSGTAH; UcTX-V (4150 Da), GALPCPCHNDSGIFWLGRSTCPAGYRKDCPS VFGV. 분석된 항균활성 펩타이드의 부분적인 N-말단 아미노산 서열을 사용하여 기존에 밝혀진 물질들과의 상동성 조사를 한 결과, 흥미롭게도 이들 펩타이드들은 말미잘 유래 신경독소와 상동성을 가지는 것으로 나타났으며, 지금까지 발견된 항균활성 펩타이드와는 유사성을 가지지 않았다. cDNA cloning을 통해 UcTX-I과 -II의 전체 일차 서열을 분석한 결과, 이들은 각각 40개(GASCDCHPFVGTYWFGISNCPSGHGYRKKCASFFGVCCVK) 및 38개(GGIPCSCKDESGIYWFGRYKCSGYRETCASIFGVCCVR)의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며 6개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다, 또한UcTX-I 및 –II의 전체 아미노산 서열에 대한 상동성을 조사 한 결과, 이들 모두 말미잘 유래 전압개폐 칼륨채널 차단독소(voltage-gated potassium channel toxins)와 약 40~50%의 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 말미잘의 칼륨채널독소는 구조적 특징에 따라 총 네 그룹으로 나뉘는데, 네 그룹의 칼륨채널독소들과 UcTX-I 및 –II의 구조를 비교 분석 한 결과, 이들은 type III에 해당하는 말미잘 칼륨채널독소와 가장 높은 유사성을 가지는 것으로 분석되었다. UcTX-I과 말미잘 유래 신경독소(APETx2 및ShK)의 항균활성을 측정한 결과, UcTX-I은 사용된 그람 양성 및 음성 균주 모두에 항균활성을 나타냈으며, 특히 Bacillus 균주에 대해 특이적으로 큰 활성을 나타내었다. UcTX-I과 마찬가지로, ShK와 APETx2도 항균활성을 나타내었다. APETx2의 경우Staphylococcus aureus 균주에 대해서만 항균활성을 나타내었고, ShK는 실험에 사용된 모든 균주(B. subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica)에 대해 강한 항균활성을 나타내었다. 정제된 UcTX-I의 조직별 발현량 비교를 위해 quantitative real-time PCR을 시행 한 결과, UcTX-I 은 인두 및 내장조직에서 가장 많은 발현량을 보였다. 인두 및 내장조직의 UcTX-I mRNA발현을 유도하기 위하여 말미잘에 Bacilus 균주를 주입한 뒤 시간변화에 따른 발현량을 관찰하였다. 그 결과, 내장 및 인두조직에서 각각 8시간과 16시간 후에 가장 높은 발현량을 나타내었다가 시간이 지남에 따라 다시 감소하는 양상을 나타냈다. 이러한 결과로 미루어보아UcTX-I뿐만 아니라 UcTX-II~V들도 말미잘의 선천면역체계에서 미생물 감염에 대한 방어작용의 한 부분을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 본 연구에서는 처음으로 민가죽해변말미잘(U. crassicornis)로 부터 말미잘의 선천면역반응에 관여하는 다섯 개의 항균활성 펩타이드를 정제하였으며, 동시에 처음으로 말미잘 신경독소들의 항균활성 펩타이드로써 다기능적 역할을 확인 한 데에 의의가 있다고 생각된다. 또한 정제된 펩타이드는 기존의 약물을 대체할 새로운 항생제제 혹은 진통제 개발에 응용 될 수 있을 것으로 여겨진다.