Regulation of macrophage polarization switch using Pyropia yezoensis glycoprotein and protective mechanisms in animal liver injury model

Abstract

염증반응은 신체의 외부감염에 대한 방어 작용과 손상에 대한 회복에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 염증반응에 관여하는 대식세포는 M1(classically activation), M2(alternatively activation) 표현형에 따라 각각의 자극반응에서 다른 역할을 수행하게 된다. M1 표현형의 대식세포는 전염증성 싸이토카인을 분비하게 되며 산화질소와 활성산소 매개물질을 생성하게 된다. 반면, M2 표현형의 대식세포는 M1 표현형의 대식세포를 M2 표현형으로 전환시키며 항염증 작용 및 손상된 조직의 회복을 촉진시킨다. 본 연구에서는 방사무늬 김(Pyropia yezoensis)에서 분리한 단백질을 이용하여 대식세포의 M1, M2 활성에 미치는 영향과 그와 연관된 질병모델에서 김 단백질의 영향에 대하여 확인하였다. 먼저 김 단백질이 RAW 264.7 마우스 대식세포의 M1 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 LPS를 자극제로 이용한 모델을 사용하였다. MTS assay 결과 김 단백질과 LPS는 대식세포의 생존율에 영향을 미치지 않았으며, RAW 264.7 대식세포의 M1 표현형에서 생성되어지는 NO, ROS의 생성을 김 단백질이 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. Western blot과 RT-PCR을 통하여 M1, M2 표현형 마커를 관찰한 결과 김 단백질이 LPS 자극으로 유도되어진 IL-6, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, NOS-2, SOCS3, M1 표현형 마커의 발현을 억제하는 것이 확인되었고, M2 표현형의 마커인 ARG1, Ym1, FIZZ1, IL-10의 발현이 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. M1 표현형과 M2 표현형에서는 세포외부의 CD항원 발현에도 차이가 발견되는데 M2 표현형에서 특이적으로 발현되어지는 CD163, CD206의 발현은 김 단백질을 처리하였을 때 증가되는 것으로 확인되었다. 이러한 대식세포 표현형 활성에는 다양한 전사인자가 관여하는데 이중 STAT3, STAT6 전사인자의 변화를 관찰한 결과 김 단백질에 의하여 인산화되어 활성이 증가하였으며, STAT6 전사인자로 매개되어지는 PPARⅴ, KLF4의 발현이 증가되는 것으로 확인되었다. 반면, M1활성을 촉진하는 NFκB와 AP-1 전사인자의 핵내 유입은 감소하는 것으로 나타났다. STAT3, STAT6의 siRNA를 이용하여 STAT3, 6 전사인자를 knock down시킨 결과에서는 김 단백질을 처리했음에도 ARG1, Ym1, FIZZ1, CD206, CD163 M2 표현형 마커의 발현이 증가하지 않는 것이 관찰되었다. 김 단백질의 간 손상모델에서의 효과를 관찰하기 위하여 Hepa 1c1c7 마우스 간암세포에 D-galactosamine(D-GalN)을 처리하여 독성을 유발하는 모델을 이용하여 생리적 변화를 관찰하였다. 그 결과, D-GalN에 노출로 저하된 Hepa 1c1c7 세포의 생존율이 김 단백질을 처리함으로써 회복되어지는 것이 MTS, LDH assay를 통하여 확인되었다. D-GalN으로 유발되는 산화적 스트레스로 인하여 상승된 TBARS가 김 단백질 농도 유의적으로 감소하였으며 D-GalN으로 저해된 SOD, CAT, GST 항산화효소의 활성이 김 단백질 농도 유의적으로 회복되어졌다. D-GalN으로 인한 세포의 독성은 MAPK 경로의 활성화가 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 김 단백질을 동시처리함으로써 MAPK의 활성화가 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다. 또한 산화적 스트레스의 억제를 담당하는 Nrf2 전사인자의 발현을 김 단백질이 촉진시키며 Nrf2로 매개되어지는 Nqo1, GST, HO-1 단백질의 발현 역시 증가함이 확인되었다. In vitro 실험에서의 결과를 토대로 in vivo에 적용하여 그 효과를 검증하기 위해 sprague dawley rat에 D-GalN과 LPS를 동시에 처리하는 모델을 사용하였다. D-GalN/LPS으로 인하여 rat의 간 조직이 손상되었는지 확인하기 위하여 혈청 GOT, GPT 수치를 측정한 결과 D-GalN/LPS가 간 손상을 유발한 것이 확인되어졌으며 김 단백질로 인하여 회복되는 것으로 나타났다. 또한 간 조직의 산화적 스트레스를 파악하기 위해 TBARS와 항산화 효소인 CAT, GST, GSH효소를 측정한 결과 D-GalN/LPS으로 상승된 TBARS는 김 단백질을 함께 투여한 군에서 저해되었으며 항산화효소인 CAT, GST, GSH의 감소는 김 단백질을 투여함으로써 회복되어졌다. D-GalN/LPS의 독성 경로에 밀접한 역할을 하는 MAPK 인산화와 염증 반응을 매개하는 iNOS, COX-2 단백질의 발현 증가 역시 김 단백질을 동시투여함으로써 대조군 수준으로 회복되어졌다. 김 단백질이 D-GalN/LPS 이외의 염증성 질환에서의 효능을 검증하기 위하여 Sprague dawley rat에 4주간 에탄올과 김 단백질을 동시 투여하는 모델을 사용하였다. 장기적인 에탄올의 섭취는 간 조직의 손상을 유발하여 혈청내 GOT, GPT 수치를 증가시켰으며, 동반되어진 산화적인 스트레스로 인하여 항산화효소인 CAT, GSH, GSH-px 효소의 활성을 감소시켰으나 김 단백질을 동시투여한 군에서는 간 조직의 손상과 CAT, GSH, GSH-px 항산화효소의 활성을 회복시켜주는 것으로 나타났다. 장기적인 에탄올 섭취로 인해 활성화된 MAPK 단백질과 CYP2E1, iNOS, COX-2 단백질 발현 증가 역시, 김 단백질을 동시 투여함으로써 대조군 수준으로 회복되어지는 것으로 확인되었다. 지금까지의 결과를 보았을 때, 김 단백질은 STAT3, STAT6 전사인자를 활성화하여 염증성 M1 대식세포활성을 항염증성 성격을 가진 M2 활성으로 전환시켜 주며, D-GalN/LPS로 유발되어지는 간 질환에서 MAPK활성의 저해와 Nrf2 전사인자의 활성 촉진 및 항산화효소의 활성을 촉진시킴으로써 보호효과를 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 장기적인 에탄올 섭취에 의한 간 손상에서도 MAPK 활성 저해와 항산화효소 활성을 촉진시킴으로써 보호효과를 가지는 것으로 나타났다.