Anti-Alzheimer’s disease and anti-diabetic principles from the heartwood of Juniperus chinensis

Abstract

자단향 (Juniperus chinensis)은 붉은색 향나무의 적자색 심재를 말하며 측백나무과 (Cupressaceae)에 속하는 상록수로서 한국, 일본 및 중국 등의 동남아시아 지역에 분포되어 있다. 중국에서는 잎을 이용하여 풍한, 감기 및 류마티스 관절염, 담마진 등에 사용되고 있으며 국내에서는 고혈압, 곽란 그리고 심복통에 사용되어 왔다. 자단향의 생리활성 효과로는 항종양, 항균, 항 말라리아, 항산화 그리고 항비만에 대한 효과가 이루어져 왔으나 알츠하이머와 당뇨에 관련 연구는 많지 않다. 이 연구의 목적은 자단향의 항 알츠하이머와 항당뇨 효능을 탐색을 위하여 추출물의 total phenolic contents (TPC)와 total flavonoid contents (TFC) 측정, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), peroxynitrite (ONOO–), 그리고 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS+) 라디칼 소거활성을 측정하였으며 acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE), -site precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE1), protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), -glucosidase 그리고 advanced glycation endproducts (AGEs)의 억제 효과를 측정하였고 여러 활성 분획으로부터 2개의 신규 화합물과 22개의 알려진 화합물을 분리하였으며 분리된 화합물의 구조 설명과 AChE, BChE, BACE1, PTP1B, -glucosidase 그리고 AGEs 억제 활성을 측정함으로써 자단향의 항 알츠하이머와 항당뇨 효능을 확인하고자 하는 것이다. 자단향에 메탄올을 이용하여 MeOH 추출물을 얻었으며 그것으로부터 유기용매 극성별 분획을 실시하여 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 분획물과 H2O 분획물을 얻었다. MeOH 추출물과 분획물의 TPC와 TFC를 측정하였으며 그 결과 TPC는 EtOAc와 n-BuOH 분획물에서 함량이 높았으며 TFC는 MeOH 추출물, EtOAc와 n-BuOH 분획물에서 높았다. 또한 MeOH 추출물과 분획물의 DPPH, ONOO–, 그리고 ABTS+ 라디칼 소거활성을 측정하였다. 그 결과 라디칼 소거활성 실험에서 EtOAc와 n-BuOH 분획물에서 강력한 라디칼 소거 활성을 보였다. 자단향의 MeOH 추출물과 용매별 분획물 AChE억제활성에서는 MeOH 추출물 > n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > H2O 분획물 순으로 억제 활성을 보였으며 BChE 억제 활성 실험에서는 MeOH 추출물과 CH2Cl2 분획물에서 양성대조군인 berberine의 IC50 값 8.48 μg/mL과 비교시 각각 IC50 값이 11.51과 13.56 μg/mL로 좋은 억제 활성을 보였다. BACE1 억제 활성 실험에서는 MeOH 추출물과 모든 분획물에서 양성 대조군인 quercetin의 IC50 값 8.14 μg/mL보다 더 강력한 억제 활성을 보였다. 자단향의 MeOH 추출물과 각 용매별 분획물의 PTP1B, -glucosidase 그리고 AGEs의 억제 활성 실험에서는 EtOAc와 n-BuOH 분획물들에서 강한 억제 활성을 보였다. 이상의 결과를 토대로 자단향 CH2Cl2, EtOAc 그리고 n-BuOH 분획물에서 효소 억제 활성이 있음을 확인하여 이들 분획물을 대상으로 silica, RP-18, sephadex LH-20 그리고 Diaion HP-20 gel등의 컬럼 크로마토그래피 실시하였으며 이들 화합물의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC, DEPT, MS, IR, UV, CD 그리고 선광도 등의 분광학적 기법과 보고된 문헌의 비교를 통해 결정하였다. 분리한 화합물은 cedrol (1), sugiol (2), widdrol (3), 9'-methoxycalocedrin (4), savinin (5), 3-oxocedrol (6), calocedrin (7), 12-hydroxywiddrol (8), 10-oxowiddrol (9), naringenin (10), α-methyl artoflavanocoumarin (11), vanillic acid methyl ester (12), taxifolin (13), aromadendrin (14), kaempferol (15), quercetin (16), (7S,8R)-dihydro-3-hydroxy-8-hydroxymethyl-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-benzofuranpropanol (17), 5,7,4-trihydroxy-2-styrylchromone (18), styraxlignolide C (19), protocatechuic acid (20), vanillic acid (21), (7R,8S)-dihydro-3'-methoxy-8-hydroxymethyl-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1'-benzofuranpropanol 4-O-β-D-glucopyranoside (22), (7S,8S)-dihydro-3'-hydroxy-8-hydroxymethyl-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1'-benzofuranpropanol 4-O-α-L-rhamnopyranoside (23) 그리고 catechin (24)으로 결정하였다. 분리된 화합물 중 화합물 11과 18은 신규 화합물이며 화합물 6, 8, 9, 17, 19, 22 그리고 23 화합물들은 자단향에서 처음 분리된 화합물이다. 자단향에서 분리된 화합물의 ONOO– 라디칼 소거활성 측정에서는 화합물 11, 13, 16, 18, 19, 23 그리고 24는 IC50 값은 각각 2.96, 2.92, 3.49, 1.19, 2.68, 3.69 그리고 3.36 μM로 양성 대조군 penicillamine (IC50 =8.01 μM)과 비교하였을때 강력한 억제 활성을 나타냈다. 분리된 화합물의 AChE 억제활성에서 화합물 16과 24는 IC50 값은 각각 9.51와 7.57 μM으로 양성 대조군 berberine (IC50 = 0.67 μM)과 비교하였을때 강한 억제 활성을 나타냈으며 BChE 억제 활성에서는 화합물 3, 7과 18은 IC50 값이 각각 30.14, 28.12와 28.80 μM으로 양성 대조군 berberine (IC50 =14.04 μM)과 비교하였을때 좋은 억제 활성을 나타냈다. 또한 BACE1억제 활성 실험에서 화합물 4, 11, 18 그리고 24는 IC50 값이 각각 16.3, 11.91, 6.25 그리고 23.23 μM으로 양성 대조군 quercetin (IC50 = 26.94 μM)과 비교하였을 때 강력한 억제 활성을 나타냈다. 분리된 화합물의 PTP1B 억제 활성에서는 화합물 11, 16 그리고 18은 IC50 값이 각각 25.27, 23.29 그리고 23.45 μM으로 양성 대조군 ursolic acid (IC50 = 9.04 μM)과 비교하였을 때 좋은 억제 활성을 나타냈다. 또한 -glucosidase 억제 활성 측정에서는 화합물 11, 15, 16과 18는 IC50 값이 각각 7.94, 10.25, 30.28, 그리고 42.51 μM로 양성 대조군 acarbose (IC50 = 112.41 μM)와 비교할 때 강한 억제 활성을 보였다. 분리된 화합물의 AGEs생성 억제 활성에서는 화합물 11과 18은 IC50 값이 각각 3.20와 3.05 μM로 양성 대조군 aminoguanidine (IC50 = 130.12 μM)와 비교했을 때 강력한 억제 활성 보였다. 분리된 화합물 중, 화합물 11과 18은 PTP1B와 -glucosidase 억제 활성에서 강한 억제를 나타냈으므로 11과 18의 효소 기질에 대한 PTP1B 저해 양상을 조사하였으며 그 결과 두 화합물 모두 혼합형 저해로 Ki 값은 각각 13.84와 7.32 μM 로 나타났다. 게다가 화합물 11과 18의 효소 기질에 대한 -glucosidase저해 양상을 조사한 결과 화합물 11은 비경쟁적 저해로 Ki 값은 13.38 μM로 나타났으며 화합물 18은 혼합형 저해로 Ki 값은 21.09 μM로 나타났다. 이상과 같은 결과를 토대로 자단향 MeOH 추출물과 분획물 및 분리된 화합물은 AChE, BChE, BACE1, PTP1B, α-glucosidase 그리고 AGEs 생성 억제를 통한 항 알츠하이머 질환과 항 당뇨 활성 보였으며 이는 알츠하이머 질환 및 당뇨병 치료를 위한 예방 및 치료제로서 이용될 수 있음을 제시한다.