Characterization of biochemical and biofunctional properties of γ-PGA produced from halotolerant marine Bacillus sp.
- Alternative Title
- 해양 유래 내염성 Bacillus가 생산하는 γ-PGA의 생화학적 효과 및 기능성에 관한 연구
- Abstract
- 본 연구는 우리나라 전통식품인 오징어 젓갈로부터 분리한 내염성 바실러스의 프로바이오틱스 특성을 평가하고, 균이 생산해내는 폴리감마글루탐산의 항산화 메카니즘과 하이드록시 라디칼에 의해 유발되는 산화적 손상으로부터 위장관 세포보호 효과에 대한 연구이다.
점질성 바이오폴리머인 폴리감마글루탐산을 생산해내는 본 균주의 프로바이오틱스 특성평가로서, 인간 장세포인 caco-2 세포에 대한 세포독성 및 용혈반응의 부재와 뛰어난 항생제 감수성으로 생균제로서의 안정성을 확인하였으며, 인체위장모델시스템을 통한 생존율 시험에서 산과 담즙산염에 대해 97% 이상의 생존률과, 세포 표면의 높은 소수성 및 강력한 응집능력으로 초기 접종 농도의 약 70%의 장부착능력을 보여주었다. 기능적인 측면에서, 그람 양성 및 음성 병원균에 광역 항균 스펙트럼을 가지고 있었으며, 특히 해양 유래 병원균인 Edwardsiella와 Vibrio 균주에 매우 강한 항균활성이 나타남을 확인하였다. 또한 강력한 항산화 활성과 β-galactosidase, phytase, bile salt hydrolase, catalase등의 기능성 효소의 생산과 더불어, 이눌린, 프럭도올리고당 뿐만 아니라 보리의 베타글루칸을 영양원으로 선택적으로 증식할 수 있는 프리바이오틱 가용능력으로, 본 균주는 동물과 인간의 프리바이오틱스로서 뿐만 아니라 수산 양식분야의 항생제 대체 생균제로서의 잠재력이 높음을 시사하였다.
본 균주가 생산해내는 세포외 점질성 바이오폴리머의 물리화학적 특성 조사를 위해 FT-IR, NMR, TGA 및 TLC를 이용하여 분석한 결과 대부분 L-glutamic acid 잔기로 이루어진 나트륨 염을 매개로 형성된 폴리감마글루탐산임을 확인하였다. 발효를 통해 고염의 조건에서 약 400kDa의 비교적 일정한 분자량의 폴리감마글루탐산을 생산하였고, 분자량과 관계없이 최고수율은 6% 염농도에서 약 26 g/L를, 400 kDa 분자량을 가지는 폴리감마글루탐산은 8% 염농도하에서 최대 24 g/L 수율을 보였다. 400kDa 분자량의 폴리감마글루탐산은 1 mg/mL 농도에서 85.2%의 하이드록시 라디칼 발생억제 능력을 가지고 있었으며 이는 발생되는 하이드록시 라디칼의 직접적인 소거능에 비해 전이금속의 킬레이션과 과산화수소 소거능을 통한 하이드록시 라디칼의 발생을 억제시키는 메카니즘으로 항산화 효과를 가짐을 본 연구를 통해 밝혔다. 하이드록시 라디칼 발생 억제 능력은 소화 위장관 모델에서 최종 약 95.3%의 활성을 유지 함으로서 구강 섭취시에도 큰 활성의 변화가 없음을 확인하였고, 1 mg/mL 농도에서 하이드록시 라디칼에 의해 발생되는 산화적 손상으로부터 DNA, protein 및 caco-2 cell을 완벽하게 보호하였다.
이러한 일련의 결과들을 통해 우리나라 전통 식품에서 분리한 안정성이 입증된 내염성 바실러스가 생산하는 400 kDa의 폴리감마글루탐산은 식품, 사료 첨가제, 화장품및 생물의학 분야에서 강력한 하이드록시 라디칼 억제제로서 항산화제와 세포보호제로서의 응용가능성을 보여주고 있으며, 본 연구는 일정한 분자량의 폴리감마글루탐산을 생산해내는 균주 및 생산방법에 관한 연구결과와 더불어 폴리감마글루탐산의 항산화 메커니즘을 밝힌 최초의 보고이다.
- Issued Date
- 2016
- Awarded Date
- 2016. 8
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교 대학원
- Alternative Author(s)
- 이종민
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 생물공학과
- Advisor
- 공인수
- Table Of Contents
- Characterization of biochemical and biofunctional properties of γ-PGA produced from halotolerant marine Bacillus sp. 1
Chapter 1. 3
In vitro evaluation of the marine-derived spore-former as promising probiotics candidate 3
Abstract 4
1. Introduction 5
2. Materials and methods 8
2.1. Bacterial strains and culture conditions 8
2.2. Caco-2 cell culture 8
2.3. Preparation of spores 9
2.4. Safety assessment 9
2.4.1. Cytotoxicity assay 9
2.4.2. Hemolytic tests 10
2.4.3. Antibiotic susceptibility 10
2.5. Acid and bile salt tolerance during simulated gastrointestinal condition 10
2.6. Bacterial adhesion 10
2.6.1. Cell surface hydrophobicity 10
2.6.2. Autoaggregation assay 11
2.6.3. Enumeration of adhered cell by direct counting 11
2.7. Antimicrobial activity 12
2.8. Antioxidants activity 12
2.9. β-Galactosidase activity 13
2.10. Phytase activity 13
2.11. Bile salt hydrolase 14
2.12. Catalase 14
3. Results and discussion 15
3.1. Safety assessment for probiotics use of SJ-10 15
3.2. Resistance to simulated gastrointestinal condition 16
3.3. Adhesion properties 17
3.4. Antimicrobial activity 19
3.5. Antioxidant activity 21
3.6. Functional enzymatic properties 22
3.7. Utilization of prebiotics 24
4. Conclusion 26
Table and Figure 27
References 36
Chapter 2. 42
Physicochemical properties, production and biological functionality of poly-γ-glutamic acid with constant molecular weight from halotolerant Bacillus sp. SJ-10 42
Abstract 43
1. Introduction 44
2. Material and methods 46
2.1. Microorganism 46
2.2. Isolation of γ-PGA 46
2.3. Physicochemical characterization of γ-PGA 46
2.3.1. Fourier transform infrared (FT-IR) spectra 46
2.3.2. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 47
2.3.3. Thermal analysis 47
2.3.4. Amino acid composition 47
2.3.5. Methylene blue staining 48
2.3.6. Molecular weight determination 48
2.4. Optimization of fermentation conditions for γ-PGA production 48
2.5. Total antioxidant activity 49
3. Results and discussion 50
3.1. Purification of γ-PGA 50
3.2. Physicochemical characteristics 50
3.2.1. FT-IR and NMR spectroscopy 50
3.2.2. Thermal analysis 51
3.2.3. Amino acids and enantiomeric composition analysis 51
3.3. Effect of NaCl concentration on the molecular weight of γ-PGA 51
3.4. Optimization of fermentation conditions for production of ~400 kDa γ-PGA 53
3.4.1. Temperature and pH 53
3.4.2. L-glutamic acid 54
3.4.3. NaCl concentrations 55
3.5. The productivity of 400 kDa γ-PGA in accordance with carbon and nitrogen sources under the optimized condition 56
3.6. Total antioxidant activity 56
4. Conclusion 58
Table and Figure 59
References 67
Chapter 3. 70
Antioxidant mechanism and gastrointestinal cytoprotective effect of γ-PGA against hydroxyl radical induced damage 70
Abstract 71
1. Introduction 72
2. Materials and methods 74
2.1. γ-PGA preparation 74
2.2. Hydroxyl radical averting capacity 74
2.3. Non site-specific and site-specific hydroxyl radical-mediated 2-deoxy-D-ribose degradation 75
2.4. Iron ions chelating activity 75
2.5. Fourier transform infrared (FT-IR) spectra 76
2.6. Hydrogen peroxide scavenging activity 76
2.7. In vitro digestion model 76
2.8. Protective effect on Hydroxyl radical mediated degradation of DNA and Protein 77
2.9. Cytotoxicity of γ-PGA on CaCo-2 cell 78
2.10. Cytoprotection of γ-PGA against hydroxyl radical 78
3. Results and discussion 80
3.1. Hydroxyl radical averting capacity of γ-PGA 80
3.2. Non site-specific and site specific scavenging activity 80
3.3. Iron chelating ability 81
3.4. Scavenging of hydrogen peroxide 83
3.5. Stability during in vitro simulated gastrointestinal tract 84
3.6. Protective effect of γ-PGA on DNA and protein 85
3.7. Cytotoxicity and cytoprotective effect to Caco-2 cell 87
4. Conclusion 89
Table and Figure 90
References 98
Summary (in Korean) 101
Acknowledgements 104
- Degree
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