Antibiofilm Effects of Chitosan-phytochemical Compounds against Biofilm-forming Food Pathogenic Bacteria

Abstract

바이오 필름(biofilm)이란 표면에 부착된 미생물 집단을 일컫는 말로 식품, 질병, 의료기기 분야뿐만 아니라 세탁기, 에어컨, 가습기를 포함한 생활가전 그리고 배수구 등 넓고 다양한 분야에서 심각한 문제를 일으킨다. 일단 바이오 필름이 형성되면 그 안의 미생물은 항생물질에 대해 상당히 증가된 저항성을 가지게 되는데, 이러한 특성은 바이오 필름 안에서 느려진 세포의 증식 속도, 미생물이 생성하는 extracellular polymeric substance (EPS)에 의한 항생물질 확산 지연 등의 내재적 요인과 세포간의 플라스미드 교환 등의 외재적 요인으로 그 메커니즘이 연구되고 있다. 본 연구에서는 항균, 항산화 및 항염증 효과를 포함한 생리활성 기능을 가진 chitosan에 caffeic acid, ferulic acid 그리고 sinapic acid와 같은 hydroxycinnamic acids를 conjugate 시킨 chitosan-phytochemical compounds를 이용하여, 바이오 필름을 형성하는 식중독 균인 Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes와 Staphylococcus aureus를 대상으로 바이오 필름 생성 억제 및 저해 효과를 측정하였다. Minimum inhibitory concentration (MIC) 와 minimum bactericidal concentration (MBC) assay를 통해 일반 부유균에 대한 항균 활성을 측정하였으며, 그 결과 전반적으로 대조구 (unmodified chitosan)보다 합성 유도체인 chitosan-phytochemical compounds가 뛰어난 활성을 나타내었다. 특히 실험에 이용된 식중독 균 중 L. monocytogenes에 대해 가장 우수한 항균 활성을 나타내었고, 그 다음으로 P. aeruginosa와 S. aureus 순이었다. Chitosan-phytochemical compounds 별로는 유사한 수준의 항균 활성이 관찰되었으나 chitosan-caffeic acid conjugate (CFA) 에서 조금 더 우수한 항균 효과가 나타났다. Chitosan-phytochemical compounds의 antibiofilm 활성 측정 실험은 크게 두 가지 경우로 나누어 진행되었다. 형성된 바이오 필름에 대한 chitosan-phytochemical compounds의 바이오 필름 저해 효과를 파악하기 위해 biofilm inhibitory concentration (BIC)와 biofilm eradication concentration (BEC) assay를 진행하였고, 다음으로 chitosan-phytochemical compounds가 바이오 필름 형성 자체를 얼마나 억제하는지 파악하기 위해 MIC의 농도 보다 낮은 sub-inhibitory concentration(sub-MIC) 수준에서 (0.5 MIC, 0.25 MIC, 0.125 MIC) 형성된 바이오 필름을 염색하는 safranin stain assay를 진행하였다. 동시에 항균 활성과 형성된 바이오 필름에 대한 저해 활성의 비교 분석을 통해, 일반 부유균 대비 바이오 필름이 가지는 항생물질에 대한 증가된 저항성을 파악하였다. Antibiofilm 활성 역시 대조구 대비, chitosan-phytochemical compounds에서 더 우수한 효과가 나타났으며 균의 종류 및 물질에 따라서도 항균 활성과 그 경향이 유사하였다. 또한 형성된 바이오 필름을 저해하는데 요구되는 chitosan-phytochemical compounds의 농도는 일반 부유균을 저해하는데 요구되는 것보다 최소 2배에서 최대 16배 높은 값을 나타내었다. 바이오 필름은 여러 단계를 거쳐 복잡한 과정으로 형성된다. 일단 미생물이 표면에 부착하면 이들은 새로운 환경에 적응하기 위해 quorum sensing을 통하여 여러가지 신호 물질을 생성하고 이에 반응한 미생물은 exopolysaccharide, extracellular DNA, Polypeptide 등 여러가지 물질로 구성된 EPS를 생성한다. 이렇게 생성된 EPS는 바이오 필름의 전반적인 3차원구조와 골격을 구성하며 미생물 집단을 더욱 단단히 한다. Sub-MIC 농도에서 safranin으로 염색된 바이오 필름은 chitosan-phytochemical compounds가 바이오 필름 형성을 얼마나 효과적으로 억제하였는지 나타낸다. 실험 결과, chitosan-phytochemical compounds의 농도가 희석됨에 따라 바이오 필름 형성은 점차 높은 비율로 관찰되었으나 바이오 필름 형성 억제 효과는 키토산 유도체의 종류 및 균 종류마다 각기 다르게 나타났다. 이에 대해서는 균의 종류마다 바이오 필름을 형성하는 구성 성분 및 구조가 다르며 항생물질에 대한 반응 또한 각기 다른 메커니즘으로 이루어지기 때문으로 그 원인을 추정하며 추후 chitosan-phytochemical compounds의 antibiofilm 메커니즘에 대한 연구를 진행할 예정이다. 현재까지 진행된 많은 연구들은 다양한 실험 방법으로 여러 가지 물질의 바이오 필름 억제 효과를 보고하고 있다. 부추, 마늘, 루이보스, 카멜리아 신네시스, 에키나세아, 감초 등의 약용 식물 1,000 μg/mL 농도는 L. monocytogenes 의 바이오 필름 형성을 25 ~ 80 % 억제한다고 하며, 또 다른 연구는 키토산이 S. aureus의 바이오 필름을 일반적으로 약 60% 정도까지 억제한다고 보고하였다. 이와 비교하였을 시 본 연구에서 이용된 Chitosan-phytochemical compounds은 바이오 필름을 형성하는 식중독 균에 대해 더 우수한 antibiofilm 활성을 보였으며 특히 L. monocytogenes에 대해 가장 뛰어난 효과를 나타내었다. 본 연구의 결과를 통해 chitosan-phytochemical compound이 항균, 항염증, 항암 활성뿐만 아니라 antibiofilm 활성을 지닌 천연 유래 기능성 물질로서 바이오 필름을 생성하는 식중독 균 제어에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.