Anti-diabetic and anti-Alzheimer’s disease potentials of aerial parts of Epimedium koreanum Nakai and its constituents

Abstract

당뇨병은 전 세계적으로 발생하고, 그 발생빈도는 대부분의 국가에서 빠르게 증가 하고 있다. Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B)는 활성화된 인슐린 수용체의 티로신 잔기를 탈인산화 시킴으로써 인슐린 저항성을 조절하고, α-glucosidase는 소장에서 탄수화물의 흡수를 지연시켜 혈당량과 인슐린 감소에 관여하는 효소이다. 따라서, 천연물로부터 분리한 PTP1B와 α-glucosidase의 저해제는 당뇨병의 예방과 치료에 중요할 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 전 세계의 4,600 만 명이 신경퇴행성 질환인 알츠하이머 질환을 앓고 있으며, 이 또한 앞으로 빠르게 증가할 것이다. β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE1)은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 β-site를 절단하여 아밀로이드 베타 (Aβ)를 생성을 조절하고, acetylcholinesterase (AChE)와 butyrylcholinesterase (BChE)는 알츠하이머 발병에 관여하는 중요한 신경전달물질인 acetylcholine (ACh)을 조절하는 효소이므로, 이 효소들의 저해제는 알츠하이머 질환의 예방 및 치료에 중요한 역할을 할 것이다. 음양곽 (淫羊藿)은 매자나무과에 속하는 다년생 초본식물인 삼지구엽초의 전초를 말린 것으로, 한방에서는 성호르몬 장애, 이뇨 작용 및 혈압 강하 작용 등에 쓰인다. 그러나 항당뇨 및 항 알츠하이머 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않으므로 이번 연구에서는 음양곽과 그 구성성분의 항당뇨 및 항알츠하이머 효과를 확인하였다. 음양곽의 MeOH 추출물, 극성에 따른 분획물 및 화합물들의 PTP1B, α-glucosidase, BACE1, AChE 및 BChE에 대한 저해 활성을 평가하고, 활성을 나타내는 화합물의 효소반응속도 연구와 분자 도킹 시뮬레이션을 통하여 저해제로서의 가능성을 확인하였다. 모든 실험에서 CH2Cl2 분획물이 가장 높은 저해 활성을 보였으며, BACE1 억제 활성 평가를 제외한 실험에서 EtOAc 및 n-BuOH 분획물이 CH2Cl2 분획물 다음으로 좋은 활성을 나타냈다. 활성을 측정한 화합물 중 icaritin 및 icariside II가 각각 11.59 ± 1.39 및 9.94 ± 0.15의 IC50 값을 보이며 PTP1B에 대한 억제 활성을 나타냈고, 74.42 ± 0.01 및 106.59 ± 0.44의 IC50 값을 보이며 α-glucosidase 억제에 좋은 효과를 보였다. 반면에, icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C, magnolol 및 (‒)-syringaresinol은 억제 효과를 보이지 않았다. PTP1B에 대해 뛰어난 억제활성을 보인 icaritin과 icariside II는 효소 반응 속도 연구를 통해 Ki 값은 각각 11.41 및 11.66 μM이며, 억제 유형은 모두 비경쟁적으로 나타났다. 분자 도킹 시뮬레이션에서 icaritin의 수산기가 PTP1B의 ASN193 잔기와 하나의 수소결합을 생성하여 ‒6.24 kcal/mol의 결합 에너지를 보였고, icariside II는 α-L-rhamnose 잔기의 수산기가 GLU276 잔기와 4개의 수소결합을 생성하여 ‒8.77 kcal/mol의 결합에너지를 보였다. 이 결과를 통해 icaritin과 icariside II가 PTP1B의 알로스테릭 자리에 결합함으로써 비경쟁적인 억제 활성을 보이는 것을 설명할 수 있다. BACE1 억제에서 icaritin과 icariside II가 IC50 35.90 ± 5.12 그리고 38.34 ± 2.65로 비슷한 활성을 보였으며, icariin은 79.02 ± 5.13의 IC50 값을 보였다. 또한, 분자 도킹 시뮬레이션에서 icaritin의 수산기가 catalytic 부위의 ASP228 잔기와 수소결합을 하고, icariside II는 catalytic 및 allosteric 부위에 모두 결합하므로 각각 경쟁적 및 혼합형 저해제로 보여진다. 반면에, AChE 억제에는 icariin, icaritin, epimedin A, epimedin B와 epimedin C가 뛰어난 효과를 보였다. AChE에 대한 억제 활성을 보인 화합물들은 효소 반응 속도 연구를 통해 모두 비경쟁적으로 AChE를 억제한다는 것을 알 수 있다. 분자 도킹 시뮬레이션 결과는 각 화합물이 AChE의 알로스테릭 조절에 관여하는 아미노산 잔기인 TYR70, ASP72, TYR121, TRP279 및 TYR334와 결합함으로써 비경쟁적으로 억제하는 것을 입증했다. 실험 결과와 화합물 구조를 비교 분석한 결과, prenylated flavonol의 C-3 및 C-7 위치에 당이 결합된 화합물이 AChE 저해에 좋은 활성을 보였다. 결론적으로, icaritin과 icariside II와 같은 icariin의 대사산물이 PTP1B 및 BACE1 억제에 뛰어난 활성을 나타냈으며, AChE 억제 효과에서는 주로 prenylated flavonol glycoside인 icariin, epimedin A, epimedin B 및 epimedin C가 가장 뛰어난 효과를 보였다. 이러한 결과는 효소 반응 속도 연구와 분자 도킹 시뮬레이션을 통해 증명할 수 있다. 따라서, 음양곽과 그 구성성분은 항당뇨 및 항알츠하이머 질병에 효과를 보이므로 당뇨병과 알츠하이머의 예방과 치료를 위한 전략으로의 가능성을 제시한다.