Anti-inflammatory mechanisms of Ethanolic Extract and Key Compounds from Sargassum serratifolium in the Rheumatoid Arthritis and Colitis Mouse Models
- Alternative Title
- 류마티스 관절염과 대장염 마우스 모델에서 톱니모자반 주정 추출물과 활성 성분들의 항염증 분자 기전
- Abstract
- 모자반속 (Sargassum)은 전세계의 조하대 지역에 널리 분포하며 모자반과 (Sargassaceae)에 속하는 대형갈조류이다. 이러한 모자반속은 전세계에 400 여종이 분포하고 있으며, 예로부터 식품과 약품으로써 소비되어져 왔다. 그 중 Sargassum serratifolium C. Agardh는 톱니모자반으로 불리며 조하대의 수중 암벽에 주로 생육하고 남해안과 제주도 연안의 섬 지역에 주로 분포한다. 모자반속에 풍부하게 함유되어 있는 생리활성 물질인 meroterpenoids는 retinol과 유사한 구조를 가지고 있으며, 항산화, 항염증 및 신경보호 활성과 같은 다양한 생리활성이 보고되고 있다.
톱니모자반으로부터 분리된 meroterpenoids의 항염증 기전은 정확히 보고된 바가 없으므로 본 연구에서는 톱니모자반 주정 추출물 (ethanolic extract of S. serratifolium, ESS)과 그로부터 분리된 3종의 화합물 [(sargahydroquinoic acid (SHQA), sargachromenol (SCM) 및 sargaquinoic acid (SQA) ]을 이용하여 peritoneal macrophages 또는 RAW 264.7 macrophage 세포주에서의 염증억제 기전을 밝히고 ESS의 류마티스 관절염 및 대장염 치료 효과를 규명하고자 하였다.
먼저, LPS로 자극된 peritoneal macrophages를 이용하여 ESS의 항염증 활성을 확인한 결과, ESS는 LPS로 유도된 nitrite oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 생성과 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및cyclooxygenase-2 (COX-2) 발현을 억제하였다. 또한, ESS는 LPS로 유도된 염증촉진성 사이토카인의 생성을 농도의존적으로 감소시켰다. LPS로 유도된 nuclear factor-κB (NF-κB)의 전사활성 및 핵으로의 이동은 ESS에 의한inhibitor κB-α (IκB-α)의 분해 감소를 통해서 억제되었다. 게다가, ESS는 LPS로 자극된 마우스 혈청의 염증촉진성 사이토카인의 생성을 억제하였다.
ESS의 주요한 항염증 화합물로 밝혀진 SHQA, SCM 및 SQA의 항염증 기전을 LPS로 자극된 대식세포인 RAW 264.7 cells를 이용하여 확인하였다. SHQA, SCM 및 SQA는 LPS로 유도된 iNOS의 발현을 억제함으로써 NO의 생성을 억제하였다. SQA는 COX-2의 발현을 억제함으로써 PGE2의 생성을 억제하였지만, SHQA와 SCM은 COX-2의 발현에 영향을 미치지 않았으나, COX-2의 활성을 억제함으로써 PGE2의 생성을 감소시켰다. SHQA와 SQA는 염증촉진성 사이토카인인 tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β 및 IL-6의 수준을 농도의존적으로 억제시켰지만, SCM의 경우는 IL-6의 생성만을 감소시켰다. 또한, LPS로 유도된 NF-κB의 전사 활성과 핵으로의 이동은 SHQA, SCM 및 SQA에 의한 IκB-α 분해 억제를 통해서 농도의존적으로 감소되었다. 이외에도 SQA에 의한 NF-κB의 활성조절은 extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)의 인산화를 매개로, SHQA는 ERK, p38 MAPKs와 Akt의 인산화를 매개로, SCM은 Akt의 인산화를 매개로 이루어진다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, SHQA, SCM 및 SQA는 전사인자인 nuclear transcription factor-E2-related factor 2 (Nrf2)의 활성화로 heme oxygenase-1 (HO-1)의 생성을 유도하고, reactive oxygen species (ROS)의 생성을 억제하였다. 이러한 결과들은 ESS, SHQA, SCM 및 SQA가 MAPKs 및 Akt로 매개된 NF-κB 경로를 억제할 뿐만 아니라 Nrf2/HO-1 경로를 활성화시킴으로써 염증성 매개인자들의 발현을 억제시킨다는 것을 확인하였고, 다양한 염증성 질환에 있어서 잠재적인 치료 및 예방 물질임을 시사하고 있다.
ESS는 현재까지 류마티스 관절염 및 대장염에 대한 효능에 대해서는 알려진 바가 없기에 본 연구에서는 앞선 실험결과들을 바탕으로, 강력한 항염증 효과를 가진 ESS를 이용하여 류마티스 관절염과 대장염 예방 및 치료효과와 그 메커니즘 검증하였다. 류마티스 관절염은 관절액 염증과 연골과 뼈 손상을 이끄는 판누스 (pannus) 형성을 특징으로 하는 자가면역 질환이다. 이 연구에서는 콜라겐으로 유도된 DBA1/J 마우스 모델 (type II collagen-induced arthritis, CIA)을 사용하여 류마티스 관절염에 대한 ESS의 치료 효과 및 관련된 메커니즘을 확인하였다. 그 결과, ESS는 관절 부종 및 체중감소를 약화시켰으며, 비장무게 또한 감소시켰다. ESS는 혈청 및 관절조직에서 염증촉진성 사이토카인 (TNF-α, IL-6와 IL-1β)의 생성을 농도 의존적으로 감소시켰고, 관절조직에서 염증성 효소 [matrix metalloproteinases (MMPs), iNOS와 COX-2), 부착분자 [P-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)과 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)]의 발현을 강하게 억제시켰다. 또한, ESS는 Akt와 MAPKs (JNK와 p38 MAPK) 인산화를 억제시킴으로써 NF-κB와 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) 신호경로를 억제하였다. 조직학적 분석을 통해서 ESS는 관절조직에서 뼈 손상 및 염증성 세포들의 유입을 강하게 억제시키는 결과를 보여주었다.
염증성 대장염은 활성화된 면역세포에서 생성되는 염증성 매개자들을 통해서 야기되는 만성적인 점막 장애이다. 이 연구에서는 dextran sulfate sodium (DSS)로 유도된 대장염에 있어서 ESS의 치료효과 및 관련된 메커니즘을 확인하였다. ESS는 체중 감소, colon 길이 감소, myeloperoxidase (MPO) 활성 및 조직학적 변화를 상당히 약화시켰다. 또한, ESS는 혈청에서 15종의 염증관련 단백질들 및 12종의 염증촉진성 사이토카인의 생성을 억제시켰다. Western blot 분석을 이용하여 colon 조직에서의 염증촉진성 사이토카인 (IL-1β, IL-17, TNF-α와 IFN-γ)과 염증성 단백질 (ICAM-1, VCAM-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13과 iNOS)의 발현이 ESS에 의해 강하게 억제되는 것을 확인하였다. 게다가, DSS로 유도된 NF-κB도 ESS에 의해서 강하게 억제되었다. 따라서, ESS에 의한 대장염 치료효과는 Akt와 JNK의 인산화 매개를 통한 NF-κB의 활성화를 억제시킴으로써 일어나는 것으로 확인되었다.
이러한 결과들은 ESS가 류마티스 관절염 및 대장염 치료를 위한 천연물 의약품 또는 건강기능식품의 소재로 사용될 수 있음을 시사하고 있다.
- Issued Date
- 2017
- Awarded Date
- 2017. 2
- Type
- Dissertation
- Keyword
- Sargassum serratifolium sargahydroquinoic acid sargachromenol sargaquinoic acid rheumatoid arthritis colitis
- Publisher
- 부경대학교 대학원
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 식품생명과학과
- Advisor
- 김형락
- Table Of Contents
- I. Introduction 1
1. Sargassum and bioactive compounds 1
2. Inflammation 3
3. Rheumatoid arthritis 5
3.1. Structure of the synovial joint 7
3.2. Type II collagen (CII) 7
3.3. Signaling pathway 9
4. Inflammatory bowel disease 10
4.1. Gastrointestinal tract 12
4.2. Dextran sulfate sodium (DSS) 14
4.3. Signaling pathway 14
5. Purpose of the study 16
II. Materials and Methods 18
1. Materials 18
1.1. Plant material 18
1.2. Chemicals 18
2. Methods 19
2.1. Isolation of anti-inflammatory compounds from Sargassum serratifolium 19
2.1.1. The extraction and isolation of compounds from S. serratifolium 19
2.1.2. NMR spectrometry 20
2.1.3. Structural elucidation of SHQA, SCM, and SQA 21
2.2. In vitro anti-inflammatory activity of ESS, SHQA, SCM, and SQA 22
2.2.1. Isolation of peritoneal macrophages 22
2.2.2. Cell culture 23
2.2.3. Cytotoxicity assay 23
2.2.4. Measurement of intracellular ROS 23
2.2.5. Measurement of NO, PGE2, TNF-α, IL-1β, and IL-6 24
2.2.6. Cyclooxygenase (COX)-2 activity assay 24
2.2.7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 25
2.2.8. Immunofluorescence analysis 26
2.2.9. Preparation of cytosolic and nuclear extracts 26
2.2.10. Transfection and luciferase assay 27
2.2.11. Western blot analysis 27
2.3. In vivo anti-inflammatory activity of ESS 28
2.3.1. LPS-induced inflammation in mice 28
2.3.2. Assay of pro-inflammatory cytokines in serum 28
2.4. Therapeutic effect of ESS on collagen-induced arthritis (CIA) in mice 29
2.4.1. Animal design 29
2.4.2. Administration of ESS 30
2.4.3. Measurement of swelling and splenic index 30
2.4.4. Histopathological analysis of ankle joints 30
2.4.5. Measurement of pro-inflammatory cytokines 30
2.4.6. Western blot analysis 31
2.5. Protective effect of ESS on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis 31
2.5.1. Induction of DSS-induced colitis in mice 31
2.5.2. Evaluation of inflammation in DSS-induced colitis 32
2.5.3. Histopathological analyses for colon tissues 33
2.5.4. Immunohistochemical staining 33
2.5.5. Myeloperoxidase (MPO) activity assay 33
2.5.6. Measurement of cytokines and chemokines in serum 34
2.5.7. Western blot analysis 34
2.6. Statistical analysis 35
III. Results and Discussion 36
Part 1. Anti-inflammatory mechanisms of ESS in LPS-stimulated peritoneal macrophages 36
1. Inhibitory effect of ESS on the production of NO and PGE2 36
2. Inhibitory effect of ESS on the expression of iNOS and COX-2 36
3. Inhibitory effect of ESS on the production of pro-inflammatory cytokines 38
4. Inhibitory effect of ESS on the translocation and activation of NF-κB 38
5. Effect of ESS on signaling pathways 41
6. Anti-inflammatory activity of ESS in mice 41
7. Identification of anti-inflammatory compounds in ESS 46
8. Discussion 49
9. Conclusion 52
Part 2. Anti-inflammatory mechanisms of SHQA, SCM, and SQA in LPS-stimulated macrophages 55
1. Anti-inflammatory mechanisms of SHQA 55
1.1. Inhibitory effect of SHQA on the production of NO and PGE2 55
1.2. Inhibitory effect of SHQA on the expression of i NOS and COX-2 55
1.3. Effect of SHQA on the release of pro-inflammatory cytokines 57
1.4. Effect of SHQA on LPS-induced NF-κB translocation and activation 57
1.5. Effect of SHQA on the phosphorylation of MAPKs and Akt 61
1.6. Effect of SHQA on the regulation of HO-1 and Nrf2 61
2. Anti-inflammatory mechanisms of SCM in LPS-stimulated macrophages 68
2.1. Effect of SCM on the production of NO and PGE2 68
2.2. Effect of SCM on the expression of iNOS and COX-2 68
2.3. Effect of SCM on the production of pro-inflammatory cytokine 70
2.4. Effect of SCM on LPS-induced translocation and activation of NF-κB 70
2.5. Effect of SCM on the phosphorylation of MAPKs and Akt 75
2.6. Effect of SCM on the regulation of HO-1 and Nrf2 75
3. Anti-inflammatory mechanisms of SQA in LPS-stimulated macrophages 83
3.1. Effect of SQA on the production of NO and PGE2 83
3.2. Effect of SQA on the production of iNOS and COX-2 83
3.3. Effect of SQA on the production of pro-inflammatory cytokines 86
3.4. Effect of SQA on the translocation and activation of NF-κB 86
3.5. Effect of SQA on signaling pathways 88
3.6. Effect of SQA on the regulation of HO-1 and Nrf2 88
4. Discussion 95
5. Conclusion 99
Part 3. Protective mechanisms of ESS on collagen-induced arthritis (CIA) in DBA/1J mice 102
1. Effect of ESS on CIA in DBA/1J mice 102
2. Effect of ESS on histological damage in joint tissues 107
3. Effect of ESS on the expression of F4/80 in paw tissues 107
4. Effect of ESS on level of pro-inflammatory cytokines in serum 107
5. Effect of ESS on the production of pro-inflammatory cytokines and chemokine in paw tissues 111
6. Effect of ESS on the production of MMP-2 and MMP-9 in paw tissues 111
7. Effect of ESS on iNOS and COX-2 expression in paw tissues 114
8. Effect of ESS on the expression of adhesion molecules 114
9. Effect of ESS on the phosphorylation of STAT3, NF-κB, and IκB-α in paw tissues 114
10. Effect of ESS on the phosphorylation of MAPKs and Akt in paw tissues 117
11. Discussion 120
12. Conclusion 124
Part 4. Protective mechanisms of ESS on DSS-induced colitis 126
1. Effect of ESS on DSS-induced colitis 126
2. Effect of ESS on histological damage and infiltration of inflammatory cells 126
3. Effect of ESS on the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines in serum 130
4. Effect of ESS on the expression of inflammatory molecules in colon tissues 130
5. Effect of ESS on the activation signaling proteins in colon tissues 138
6. Discussion 141
7. Conclusion 145
IV. References 147
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