Characterization and molecular cloning of a class I ADP-ribosylation factors (ARFs) –like genes from

Abstract

ADP-ribosylation factor(ARF)는 small GTPases에 속하며 면역과 관련된 신호전달인자 중 하나이다. 또한 small GTPases는 zebra fish에서 선천적 면역계의 확고한 기반을 제공하고 있다고 알려져 있다. ARF는 small GTP-binding proteins이며, 막의 이동과 actin- cytoskeleton의 형성을 조절하는 것과 관련이 있다. ARF는 단백질 서열, 단백질 분자적 무게, 유전자 구조와 계통학적 분석에 따라 3개의 class로 나누어진다. class I에는 ARF1, ARF2, ARF3가 속하며, class II에는 ARF4, ARF5, class III에는 ARF6가 속한다. class I에 해당하는 ARF는 골지체와 연관되어져 있으며, phospholipase D의 활성화에 필요한 2차 전달자 역할을 한다. 척추동물에 속하는 어류에서는 genome-duplication이 존재한다고 알려져 있으며, 넙치에서도 또한 존재한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 넙치(Paralichthys olivaceus)에서 유래한 class I에 해당하는 ARF의 duplication gene인 ARF1b, ARF1c, ARF3a의 cDNA library를 구축한 후, PoARF1b, PoARF1c, PoARF3a를 클로닝하여 cDNA full sequence를 밝혀냈다. 그 결과 PoARF1b, 1c, 3a (PoARFs)의 open reading frame은 각각 PoARF1b (544bp), PoARF1c (537bp), PoARF3a (546bp)의 길이를 가지고 단백질의 무게는 약 20kDa으로 확인되었다. PoARFs의 조직별 발현양상을 RT-PCR과 real-time PCR(qPCR)로 분석한 결과 PoARF1b와 1c는 아가미에서, PoARF3a는 뇌에서 가장 발현양이 높게 나타났고 공통적으로 ARF 세 가지 모두 근육에서 가장 낮은 발현양을 나타냈다. 면역세포들과의 연관성을 확인하기 위하여 LPS, Con A/PMA, PolyI:C를 넙치에 자극하였고, 염증 사이토카인 IL-1b와 IL-6 및 Mx gene을 면역자극지표로 사용, qPCR을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 넙치의 PLD1A와 1B의 패턴과 PoARF1c의 패턴이 거의 일치하는 것을 확인하였고, 이것은 ARF가 PLD의 면역반응을 매개한다는 기존의 연구와 일치하였다. 또한 transfection과 site mutation analysis를 통하여 PoARFs가 골지체에서 기능하며 이것은 GTP나 GDP 바인딩 상태에 의존적인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 class I에 해당하는 ARF가 골지체에서 기능한다는 기존의 연구결과와 일치한다.