Cloning, Expression Analysis and Enzymatic Characterization of Cathepsin L’s from the Inshore Hagfish (Eptatretus burgeri)

Abstract

먹장어(Eptatretus burgeri)는 원구류강 먹장어목 꾀장어과에 속하는 동물로 무악어류이며, 척추동물 중 가장 초기의 상태를 가진 것으로 알려져 발생학적으로 중요하다. 본 연구에서는 초기 상태의 척추동물인 먹장어의 Cathepsin L(EbCtL) cDNA들을 클로닝하여 발현 및 효소학적특성을 분석하였다. 그 결과 EbCtL1a와 EbCtL1b은 325 아미노산을 암호화하는 978염기쌍으로 구성되며, EbCtL2는 324 아미노산을 암호화하는 975염기쌍으로 구성되어있다. Cathepsin L들의 proregion에서 ERFNIN, GNFD motif가 존재하여 Cathepsin L subfamily라는 것을 보여준다. pro-mature EbCtL’s(proEbCtL’s) cDNA들을 pGEX 4T-1 벡터 시스템을 이용하여 E.coli 균주인 BL21(DE3) 내에서 발현시켰으며, 재조합 단백질은 약 55kDa의 분자량을 가졌다. proEbCtL’s의 활성은 Z-FR-AMC, Z-LLE-AMC와 같은 합성형광 펩타이드 기질을 이용하여 측정하였으며, proEbCtL1a에서 추가적으로 AAF-AMC 합성형광 펩타이드 기질을 사용하여 측정하였다. 적정 pH는 proEbCtL1a(pH 8, 9.5 그리고 10), proEbCtL1b(pH7) 그리고 proEbCtL2(pH4.5)였다. proEbCtL’s의 저해제로는 Antipain 과 Chymostain이 대체적으로 높은 저해률을 보였으며, 메탈이온과 계면활성제를 함께 반응시켰을때 ZnSO4, CuSO4, HgCl2 그리고 SDS에서 proEbCtL’s 의 활성을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.