Purification and characterization of antimicrobial material, a 40S ribosomal protein S30 from the epidermal mucus of rock bream, Oplegnathus fasciatus

Abstract

어류의 상피 조직 및 상피 점액질은 외부 환경에 존재하고 있는 병원체로부터 자신의 생체를 보호하기 위해서 다양한 항균물질을 분비한다고 알려져 있다. 본 연구에서, 돌돔의 상피 점액질의 산 추출물은 다양한 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 항균활성을 나타냈으며, 어병세균인 Aeromonas hydrophila와 Edwardsiella tarda에 대해서도 항균 반응을 나타냈다. 상피 점액질의 산 추출물은 Trypsin처리에 의해 항균활성이 대부분 소실되었지만 열, 산성 및 염기성 조건하에서는 활성이 유지되었다. 이러한 결과는 추출물에서 항균 활성을 나타내는 물질이 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이라는 것을 의미한다. 돌돔의 상피 점액질 추출물을 사용하여 역상, 양이온 및 겔 크로마토그래피로 항균물질을 정제하였으며, 정제 과정에서 각각의 분획에 대한 항균 활성은 Staphylococcus aureus를 사용하여 확인하였다. 정제한 물질의 N-말단의 부분적인 아미노산 서열을 분석하기 위해서 Edman 분해법을 행한 결과, N-말단으로부터 25번째 아미노산 잔기까지 분석되었다. 이러한 부분적인 아미노산 서열의 상동성을 조사하기 위해서 기존에 알려진 단백질의 아미노산 서열과 비교 분석하였고, 그 결과 정제된 물질은 척추동물의 40S ribosomal protein S30 (RPS30)의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 그리고 정제한 물질의 완전한 아미노산 서열을 알아보기 위해서 cDNA 클로닝을 진행하였다. 한편, cDNA의 primer를 제작하기 위해서 돌돔의 아가미로부터 밝혀진 RPS30의 cDNA EST library를 사용하였다. 합성 primer와 돌돔 상피조직으로부터 추출한 total RNA를 이용하여 제작된 cDNA로 클로닝한 결과, 정제된 단백질은 180개의 뉴클레오타이드로 구성된, 59개의 아미노산으로 이루졌고 전체 뉴클레오타이드 서열은 571개임을 확인하였다. 돌돔 RPS30의 이론적인 분자량은 6,673.84 Da이며, pI 값은 11.92이다. cDNA 클로닝에 의해 확인된 돌돔 RPS30의 일차 구조는 다른 어류들 (제브라 피쉬, 연어, 금붕어)의 RPS30 일차구조와 동일하였다. 그러나 다른 척추 동물의 RPS30 일차구조와는 총 59개의 아미노산들 중에서 2개의 아미노산 잔기가 치환(20Asp→20Ala, 36Ile→36Met )되어 있다. 굴토끼의 RPS30 삼차원 구조를 토대로 돌돔 RPS30을 homology modeling한 결과, 돌돔 RPS30은 N-말단부터 11-15번째 잔기에 짧은 α-helix와 30-41번째 잔기에 긴 α-helix를 포함하는 구조를 형성하고있다. 따라서 정제된 돌돔 RPS30은 높은 등전점과 많은 Arg과 Lys 잔기를 가지고 있는 염기성 단백질이며, 이러한 특징은 기존에 밝혀진 수많은 염기성 항균 펩타이드와 유사한 성질을 가질 것이라고 생각된다. 본 연구에서 돌돔 RPS30은 생체 내에서 주 기능 중 하나인 eukaryotic 40S ribosome subunit의 구성 역할을 하는 동시에 돌돔의 상피 점액질에서 선천성 면역 반응에 관여하는 중요한 항균 물질로 작용한다고 추측된다. 뿐만 아니라 수산 양식 산업에서 중요한 자원 중의 하나인 돌돔으로부터, 돌돔 RPS30과 같은 항균 활성 물질의 특성을 밝히는 연구는 천연항균물질의 선도물질 개발과 같은 고부가가치 산업을 비롯하여 수산 양식에 관련된 질병예방, 폐사율 감소 등 수산 양식 산업에 기여할 방안을 모색할 수 있는 계기가 될 것이라 생각된다.