Study on application of light emitting diode (LED) to disease control and wound healing in fish
- Abstract
- 최근에 LED를 이용하여 인체의 상처 치료나 감염균 제어에 대한 연구가 많이 진행 되고 있으나, 수산생물에 적용한 예는 전무하다. 더군다나, 심각해지는 항생제 오남용 문제를 줄이기 위한 친환경적 대안은 절실하다. 본 연구의 목적은 LED 단파장 빛을 이용하여 수산생물 병원체의 저감화 기술개발 및 물리적 상처치료를 위한 유효 LED 광조건 도출과, 도출된 유효한 광조건이 어류에 미치는 영향을 결정하는 것이다.
Chapter 1에서는 청색 LED (405와 465 nm)를 이용하여 7종의 어병세균(Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis), 기생충(scuticociliate; Miamiensis avidus) 그리고 바이러스 (VHSV; Viral hemorrhagic septicemia)에 대한 감수성 유무를 확인하였다. 일부 세균종은 465nm 파장의 노출에 완전히 사멸되지 않았지만, 405nm에 의해 모든 종이 불활화되었다. 특히, P. damselae, V. anguillarum 및 E. tarda와 S. iniae, A. salmonicida 및 S. parauberis는 각각 405와 465nm에 보다 높은 감수성이 존재 했으며, 이는 세균 종에 따라 감수성이 높은 파장대가 다름을 의미한다. 청색 LED 파장의 다양한 광량에 대한 E. tarda의 사멸 정도를 측정한 결과, 광량과 조사시간 간에 높은 거듭제곱 관계의 상관성이 있음을 확인했다. 또한 청색 LED가 E. tarda에 감염된 넙치와 비단잉어가 각각 건강한 개체와 함께 수용되어 있는 수조의 병원체를 저감화시키는지 확인한 결과, 대조구에 비해 사육수 내의 E. tarda 농도는 유의적으로 감소하였을 뿐만 아니라 감염된 비공격 어류의 비율도 낮은 것을 확인하였다. 또한, 청색파장에 의해 저감화되는 것이 확인된 스쿠티카충과 VHSV 이들이 사멸함에 있어 LED의 광량과 조사시간 간에 강한 거듭제곱의 상관관계가 있는 것을 확인하였으며, 청색 LED 파장에 의해 스쿠티카충의 apoptosis가 유도되어 사멸되는 메커니즘을 최초로 확인하였다. 이는 스쿠티카충에 감염된 넙치의 사육수조를 405nm로 조사한 그룹이 대조구에 비해 상대생존율이 60% 이상 되어 향후 LED를 이용한 병원체 저감화 기술 개발에 있어 중요한 자료가 될 것으로 기대된다.
Chapter 2에서는 Chapter 1에서 도출된 유효 광 조건이 잉어와 넙치에 미치는 영향을 피부와 안구조직의 병리조직학적 검사, plasma cortisol 농도와 두신의 stress, 생체리듬 및 면역 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과 안구조직의 시세포가 밀집해 있는 retina부분의 Melanin granules (Rod Outer Segment)과 Photoreceptor가 일시적으로 두꺼워지는 변화가 관찰 되었지만 전반적으로 대조구와 빛조사구 간에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았으며 관련 스트레스 및 면역 관련 유전자 발현과 혈중 cortisol 농도 또한 유의적으로 차이가 없었다. 하지만, 405nm를 매일 24시간(24h Light: 0h Dark) 조사한 넙치 실험구의 경우 melatonin-3 유전자의 발현이 405nm 매일 12시간(12h Light: 12h Dark) 조사구에 비해 유의적으로 감소하는 것이 확인되어 오랜 시간의 LED 조사는 생체리듬의 저하와 같은 부작용을 나타낼 수 있음을 추론 할 수 있었다.
Chapter 3에서는 상피증생 등이 가속화 되어 상처회복이 빠르게 일어날 수 있는 유효파장대를 도출 하기 위해 다양한 광량의 청색(465nm), 녹색(520nm), 적색(640nm) 파장을 잉어의 상피유래세포인 EPC cell line에 조사하여 증식속도를 관찰한 결과 160μ·mol·m-2·s-1 의 5 20nm와 40-80μ·mol·m-2·s-1의 640nm가 가장 높은 상피 증생 효과 (대략 160% 증식)를 나타내었다. 특히, 넙치에 인위적인 상처를 유발 후, 520nm의 조사는 물리적 상처의 회복속도가 증가하는 것이 관찰 되었다. 이는 빛의 조사가 피부 상피의 re-epithelization의 속도를 증가시키는 것을 조직학적인 방법으로 확인할 수 있었으며, 상처치유와 관련 유전자(MMP-13)와 염증 관련 cytokine을 코딩하는 유전자 발현의 유의적 변화를 확인할 수 있었다.
본 연구에서 보여주고 있는 LED 단파장 조사의 감염성 질병 컨트롤 가능성과 어류에 쉽게 일어나는 피부 상처의 신속한 치유 가능성은 항생제 등의 화학요법을 대체할 수 있는 친환경적인 방법이 될 수 있음을 시사하고 있으며, 향후 실질적인 대체방법의 개발을 위한 중요한 기초자료가 될 것으로 판단된다.
- Issued Date
- 2017
- Awarded Date
- 2017. 2
- Type
- Dissertation
- Keyword
- LED Photoinactivation wound healing
- Publisher
- 부경대학교 대학원
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 수산생명의학과
- Advisor
- 김도형
- Table Of Contents
- GENERAL INTRODUCTION 1
1. Aquaculture 1
2. Outbreak of disease in aquaculture 4
2.1. Parasitic pathogens in Korea 5
2.2. Bacterial pathogens in Korea 11
2.3. Viral pathogens in Korea 14
3. Limitation of current disease control strategy 17
4. Photodynamic / photoinactivation therapy 19
5. The Objectives of this study 20
Chapter 1. 21
Photo-inactivation of aquatic pathogens using LED 21
1. Introduction 22
2. Materials and method 24
2.1. LED source 24
2.2. Bactericidal effects of major pathogens 26
2.2.1. Bacterial strains and identification 26
2.2.2. Antibacterial activity of LEDs with different light wavelength 27
2.2.3. Antibacterial activity of LEDs with different initial bacteria density 29
2.2.4. Bacterial inactivation by LED illumination 30
2.2.5. Effect of LED illumination on bacterial infection using fancy carp 31
2.2.5.1. Fish 31
2.2.5.2. Cohabitation challenge 32
2.2.5.3. Viable E. tarda counts in rearing water and tissues 33
2.2.6. Effect of 405 nm illumination on bacterial infection with different photoperiods 35
2.2.6.1. Fish 35
2.2.6.2. Cohabitation challenge 35
2.2.6.3. Viable E. tarda counts in rearing water and tissues 36
2.3. Anti-parasitic effects with different colors of LED against Miamiensis avidus 38
2.3.1. Parasite 38
2.3.2. Anti-parasitic effects on LED light 38
2.3.3. Flow cytometry analysis 39
2.3.4. Effect of blue LED light on parasitic infection in olive flounder 40
2.3.4.1. Anti-parasitic efficacy of blue LED light 40
2.3.4.2. Anti-parasitic efficacy test wtih different photoperiods of 405nm 41
2.4. Anti-viral effects of blue LED against VHSV 42
2.4.1. Viruses 42
2.4.2. Plaque assay 43
2.4.3. Anti-viral effects with different LEDs exposures 43
2.4.4. VHSV inactivation by LED illuminance 44
2.5. Statistical analysis 45
3. Results 46
3.1. Bactericidal effects against bacterial pathogens 46
3.1.1. Bactericidal efficiency with different light wavelength 46
3.1.2. Bacteriostatic or bactericidal effects of blue LED with different initial bacterial density 50
3.1.3. Effect of light intensity on antibacterial activity 52
3.1.4. Cohabitation challenge in fancy carp under different wavelengths 54
3.1.5. Cohabitation challenge in olive flounder under different photoperiods 57
N.D. = No detection 58
3.2. Anti-parasitic effects of blue LED 60
3.2.1. Photo-inactivation about different wavelength of LEDs against Miamiensis avidus 60
3.3. Anti-viral effects of LEDs against VHSV 70
3.3.1. In vitro susceptibility of different wavelength against VHSV 70
3.3.2. Antiviral efficiency depending on light intensity and exposure time 72
4. Discussion 74
4.1. Antibacterial effect on blue LED 74
4.2. Anti-parasitic effect of blue LED 79
4.3. Anti-viral effect on blue LED 82
Chapter 2. 83
Effects of blue LED on teleost fish 83
1. Introduction 84
2. Materials and methods 86
2.1. Determination of potentially risk assessment of blue light in carp 86
2.1.1 Risk assessment of blue LED in carp 86
2.1.2 Determination of relative melanin granules and photoreceptor thickness in normal fancy carp 88
2.1.3. Physiological effects on LEDs 89
2.1.4 Real-time (quantitative) PCR analysis 90
2.2. Risk assessment of 405 nm with different photoperiods on olive flounder 92
2.2.1. Fish maintenance 92
2.2.2. Plasma analysis 94
2.2.3. Determination of relative melanin granules and photoreceptor thickness in normal olive flounder 95
2.2.5. cDNA synthesis and qPCR analysis 96
2.3. Statistical analysis 99
3. Results 100
3.1. Risk assessment of blue LED in carp 100
3.1.1. Pathology 100
3.1.2. Relative thickness of photoreceptor and melanin granules of fancy carp 102
3.1.3. Expression of stress related-genes in the head kidney of fancy carp 104
3.1.4. Feed intake 105
3.2. Risk assessment of 405 nm LED with different photoperiods on olive flounder 106
3.2.1. Plasma cortisol 106
3.2.2. Eye pathology 107
4. Discussion 114
4.1 Possible harmful effects of 405 and 465 nm irradiation on fancy carp 114
4.2 Possible harmful effects of 405 nm with different photoperiod on olive flounder 116
4.3 Possible harmful vs beneficial effects of 405 nm 117
Chapter 3 119
Wound healing effects of LED on olive flounder, Paralichthys olivaceus 119
1. Introduction 120
2. Materials and method 121
2.1. Ethics and animals 121
2.2. LED source 122
2.3. Cells 123
2.4. Crystal violet cell proliferation assay 124
2.5. In vivo exp. 1 wound healing effects using LED against serious razor wound 125
2.6. In vivo exp. 2 Survival rate after serious razor wound 126
2.7. In vivo exp. 3 wound healing effects using LED against desquamated wound 127
2.8. Pathological analysis 128
2.9. Total RNA extraction and synthesizing cDNA 129
2.10. Real time PCR (Quantitative PCR) 130
2.11. Statistic analysis 132
3. Results 133
3.1. EPC proliferation 133
3.2. Wound recovery after serious razor wound (1st in vivo) 135
3.3. In vivo exp. 2 Survival rate after serious razor wound 138
3.4. In vivo exp. 3 Survival rate after serious razor wound 140
3.4.1. Accumulated mortalities 140
3.4.2. Wound recovery 142
3.4.4. Gene expression level 151
3.4.3. Pathological analysis 144
4. Discussion 153
Summary 156
Acknowledgement 160
References 164
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