Vascular Anti-inflammatory Mechanisms of Sargassum serratifolium Ethanolic Extract, Sargachromenol, and Sargaquinoic Acid in Human Umbilical Vein Endothelial Cells and C57BL/6J Mice
- Alternative Title
- 톱니모자반 주정 추출물과 그로부터 분리된 sargachromenol 및 sargaquinoic acid의 인간 제대정맥 내피세포와 C57BL/6J 마우스에서의 혈관염증 억제기전
- Abstract
- 톱니모자반 (Sargassum serratifolium C. Agardh)은 해양 갈조류로 모자반과 (Sargassaceae)에 속하며 국내의 동해안과 남해안에 자생하고 있다. 그러나 아직 톱니모자반의 생리활성에 대해서 자세하게 연구된 바가 없으므로 본 연구에서는 톱니모자반의 주정추출물 (ethanolic extract of S. serratifolium, ESS)과 그로부터 분리된 유효성분인 sargachromenol (SCM)과 sargaquinoic acid (SQA)의 혈관염증 억제효과를 밝히고자 한다.
죽상동맥경화는 혈관에서 T 세포, 대식세포, 혈관내피세포, 혈관평활근세포 등과 같은 여러가지 세포들이 내•외부의 자극을 받아서 일어나는 만성염증질환이다. 이 염증 반응은 지질축적, 혈관평활근세포의 증식, 내피의 기능장애, 세포 외 기질분해 등의 복합적인 반응의 상호작용에 의해서 일어난다. 본 연구에서는 혈관내피세포와 mouse 동맥에서 ESS, SCM, 및 SQA의 혈관염증 억제효과를 밝히고자 하였다.
In vitro 실험에서는 인간제대정맥세포(HUVEC)에 각각 ESS, SCM, 및 SQA를 농도별로 전처리 한 후 10 ng/mL 의 농도로 tumor necrosis factor (TNF)-α, 로 자극하여 혈관염증 억제효과를 분석하였다. ESS, SCM, 및 SQA는 단핵구의 내피로의 부착에 관여하는 세포부착인자인 intracellular cell adhesion molecule (ICAM)-1과 vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제시켰다. 또한 SQA는 monocyte를 혈관내막으로 이끄는 chemokine인 monocyte chemoattractant protein (MCP)-1과 interleukin-8의 발현을 강하게 억제시켰고, ESS와 SCM 역시 MCP-1 발현을 억제시켰다. 또한, ESS, SCM, 및 SQA가 인간유래 monocyte인 THP-1세포와 TNF-α로 유도된 HUVEC 사이의 부착을 억제할 수 있는지 2′,7′-Bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein 형광물질을 이용하여 분석하였다. 그 결과 ESS, SCM, 및 SQA 모두 농도 의존적으로 두 세포간의 부착을 억제하였다. ICAM-1, VCAM-1 그리고 MCP-1의 전사를 조절하는 주요 전사인자인 nuclear factor kappa B (NF-κB)의 활성화를 immunocytochemistry와 Western blot을 통해서 분석한 결과 ESS, SCM 그리고 SQA 모두 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 NF-κB의 핵으로의 이동을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 이러한 NF-κB 활성억제는 ESS, SCM, 및 SQA의 세포 내 활성산소종의 생성억제를 통해서 일어나는 것으로 밝혀졌다.
동물 실험모델에서는 C57BL/6J 쥐를 이용하여 혈관에서의 ESS, SCM, 및 SQA의 혈관보호효과를 분석하였다. 우선 C57BL/6J 쥐를 4그룹으로 나누어 대조군, 고콜레스테롤 식이, 고콜레스테롤 사료 함께 90 mg/kg/day 및 180 mg/kg/day ESS를 섞어 만든 식이를 공급하였다. 10주 뒤 쥐의 혈청에서 chemokine인 MCP-1과 KC의 분비를 분석해 본 결과 90 mg/kg/day와 180 mg/kg/day 식이를 공급한 두 군 모두 두 chemokine 분비가 유의적으로 감소되었다. 또 대동맥 조직을 마쇄하여 추출한 단백질을 western blot으로 동맥경화 관련인자들을 분석한 결과 TNF-α에 의해서 단백질 발현이 증가한 반면 ESS에 의해서 유의적으로 감소되었음을 관찰하였다. 다음으로 TNF-α (25 μg/kg/day)로 유도된 C57BL/6J 쥐를 이용하여 SCM과 SQA의 혈관염증 억제효과를 분석하였다. SCM (25 mg/kg/day) 또는 SQA (10 mg/kg/day)를 경구투여한 후에 TNF-α로 복강투여한 군에서는 TNF-α만을 복강투여한 군에 비해서 혈청 MCP-1과 KC와 같은 chemokine 농도가 낮게 나타났다. 그리고 SCM 투여군의 동맥조직내 단구세포 부착인자인 ICAM-1 및 VCAM-1과 세포외 기질을 분해하는 효소인 matrix metallopeptidase-2와 -9이 비투여군에 비해 유의적으로 감소되었다.
이러한 결과들을 종합해보면, 죽상동맥경화로 이끄는 혈관염증이 ESS에 의해서 억제되었으며, 이러한 효과는 ESS의 유효성분인 SCM과 SQA에 의한 것으로 판단된다. 따라서 ESS는 죽상동맥경화와 같은 심혈관질환을 예방하는 건강기능성 식품 소재로의 활용이 가능할 것으로 판단된다.
- Issued Date
- 2017
- Awarded Date
- 2017. 2
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교 대학원
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 식품생명과학과
- Advisor
- 김형락
- Table Of Contents
- Chapter I. Literature Review 1
1. Biological activity of marine algae 2
2. Atherosclerosis 4
3. Tumor necrosis factor (TNF)-α 6
4. Vascular inflammation mediators 8
4.1. Adhesion molecules 8
4.2. Chemokines 9
4.3. Matrix metalloproteinases (MMPs) 10
4.4. Nuclear factor-kappa B (NF-κB) 10
4.5. Reactive oxygen species (ROS) 10
5. Purpose of the study 11
Chapter II. Ethanolic Extract of Sargassum serratifolium Suppresses Tumor Necrosis Factor-α-Induced THP-1 Adhesion to Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Vascular Inflammation in High Cholesterol Diet C57BL/6J mice 13
1. INTRODUCTION 14
2. MATERIALS AND METHODS 16
2.1. Materials 16
2.2. Preparation of ESS 16
2.3. Cell culture and treatment 17
2.4. Measurement of cell viability 17
2.5. Cell-based ELISA 18
2.6. Monocyte adhesion assay 18
2.7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 19
2.8. Preparation of cytosolic and nuclear extracts 19
2.9. Western blot analysis 21
2.10. Intracellular reactive oxygen species (ROS) measurement 21
2.11. Immunofluorescence analysis 22
2.12. Animal study.with high cholesterol diet (HCD)22
2.13. Collection and preparation in vivo samples 22
2.14. Histological analysis 24
2.15. Statistical analysis 24
3. RESULTS 25
3.1. ESS inhibits TNF-α-induced binding of monocytes to HUVECs 25
3.2. ESS inhibits the production of TNF-α-induced adhesion molecules in HUVECs 25
3.3. ESS inhibits TNF-α-induced MCP-1 and MMP-9 protein expression 30
3.4. ESS inhibits TNF-α-induced NF-κB translocation and ROS production in HUVECs 30
3.5. Effects of ESS on aortic structure change in the intima layer of artery and thickness in HCD-fed C57BL/6J 34
3.6. Dietary supplementation of ESS inhibits HCD-induced vascular inflammation in C57BL/6J mice 36
3.7. EC50 value of isolated compounds from ESS on TNF-α-induced ICAM-1 and VCAM-1 expressions in HUVECs 36
4. DISCUSSION 39
Chapter III. Sargachromenol Protects against TNF-α-Induced Vascular Inflammation in Primary Vascular Endothelial Cells and C57BL/6J Mice 44
1. INTRODUCTION 45
2. MATERIALS AND METHODS 47
2.1. Materials 47
2.2. Isolation of SCM 47
2.3. Spectrometry 48
2.4. Structural elucidation of SCM 48
2.5. Mass spectrometry analysis 49
2.6. Cell culture and viability assay 49
2.7. Cell-based ELISA 51
2.8. Monocyte adhesion assay 51
2.9. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 52
2.10. Determination of MCP-1 level 52
2.11. Preparation of cytosolic and nuclear extracts 54
2.12. Western blot analysis 54
2.13. Intracellular reactive oxygen species (ROS) measurement 55
2.14. Immunofluorescence analysis 55
2.15. TNF-α-induced animal model 55
2.16. Collection and preparation samples 56
2.17. Serum analysis 56
2.18. Statistical analysis 58
3. RESULTS 59
3.1. Effect of SCM on TNF-α-stimulated binding of monocytes to HUVECs....59
3.2. Effect of SCM on the production of TNF-α-stimulated adhesion molecules 59
3.3. Effect of SCM on TNF-α-stimulated MCP-1 64
3.4. Effect of SCM on TNF-α-stimulated NF-κB translocation 64
3.5. Effect of SCM on TNF-α-stimulated ROS production 68
3.6. Effect of SCM on TNF-α-stimulated MMP-9 expression 68
3.7. Effect of SCM on splenic index in TNF-α-stimulated C57BL/6J mice 71
3.8. Effect of SCM on TNF-α-induced secretion of soluble adhesion molecules
and chemokines in C57BL/6J mice serum 71
3.9. Effect of SCM on TNF-α-induced secretion of inflammatory and atherogenic
protein markers in C57BL/6J mice serum 71
3.10. Effect of SCM on TNF-α-induced expression of vascular inflammatory molecules in C57BL/6J mice aorta 74
4. DISCUSSION 79
Chapter IV. Sargaquinoic Acid Inhibits TNF-α-Induced NF-κB Signaling, Thereby Contributing to Decreased Vascular Inflammation in HUVECs and C57BL/6J Mice 84
1. INTRODUCTION 85
2. MATERIALS AND METHODS 87
2.1. Materials 87
2.2. Isolation of SQA 87
2.3. Spectrometry 88
2.4. Mass spectrometry analysis 89
2.5. Cell culture and viability assay 89
2.6. Cell-based ELISA 91
2.7. Monocyte adhesion assaym91
2.8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 92
2.9. Intracellular ROS Measurement 92
2.10. Preparation of cytosolic and nuclear extracts 92
2.11. Western blot analysis 94
2.12. Immunofluorescence analysis 95
2.13. TNF-α-induced animal model 95
2.14. Collection and preparation samples97
2.15. Serum analysis 97
2.16. Statistical analysis97
3. RESULTS 98
3.1. SQA inhibits TNF-α-induced binding of Monocytes to HUVECs 98
3.2. SQA inhibits the production of TNF-α-induced adhesion molecules 98
3.3. SQA inhibits TNF-α-induced chemokine production 103
3.4. SQA inhibits TNF-α-induced NF-κB activation in HUVECs 103
3.5. SQA inhibits TNF-α-induced ROS production 107
3.6. SQA inhibits TNF-α-induced MMP-9 secretion 107
3.7. Effect of SQA on splenic index in TNF-α-stimulated C57BL/6J mice 110
3.8. SQA inhibits TNF-α-induced secretion of MCP-1, KC, and IL-1β in C57BL/6J mice serum110
3.9. SQA inhibits TNF-α-induced secretion of inflammatory and atherogenic protein markers in C57BL/6J mice serum 110
3.10. SQA inhibits TNF-α-induced COX-2 and MCP-1 expression in C57BL/6J mice aorta 115
4. DISCUSSION 117
Conclusionn 122
References 124
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