Genetic diversity and population structure of manila clam, Ruditapes philippinarum based on SNP and MS DNA markers

Abstract

바지락, Ruditapes philippinarum (영명: Manila clam)은 백합과에 속하는 패류로 우리나라 서해안의 갯벌을 비롯해, 중국, 일본 및 사할린뿐만 아니라 프랑스, 스페인, 영국, 미국, 캐나다 등 전 세계적으로 여러 나라에 널리 서식하며, 우리나라는 중국 다음으로 생산량이 많다. 바지락은 맛 또한 시원하고, 영양학적으로도 칼슘, 철, 인, 비타민 B2 및 감칠맛을 내는 타우린과 베타인 글루탐산, 메티오닌, 그리고 맛을 좌우하는 핵산이 풍부하게 들어있어 식용으로 즐겨먹는 수산물이다. 생태학적으로는 담수의 영향을 받는 조간대부터 수심 10m 내외의 사니질이나 모래와 가는 자갈이 섞여 있는 모래펄에 서식하며, 생활 적정수온은 23℃내외이고, 산란기는 6~8월이다. 바지락의 수명은 약 8~9년이지만, 출하 가능한 상품크기로의 성장은 2~3년 내외이며, 번식과 성장이 빠르고 이동을 거의하지 않아 우리나라의 중요한 양식 대상종이라 할 수 있다. 하지만, 이처럼 중요한 양식대종임에도 불구하고 계절적 요인, 환경 변화 및 오염, 서식지 감소 등에 따른 복합적 요인들로 인한 질병발생 및 생리적 스트레스 등으로 인해 폐사하는 등 바지락 자원이 감소하고 있는 추세이다. 이에 따라, 국내 바지락 수요를 충당하기 위해 수입 의존도가 증가하고 있으며, 양식용 종묘 또한 확보에 많은 어려움이 있어 외국으로부터 종묘를 수입하는 실정이다. 게다가, 국내산과 수입산 바지락의 가격 차이로 인해 중국산 바지락 종패를 수입해 우리나라 연안에 살포하거나, 수입된 중국산 바지락을 국내산으로 속여 시중에 유통시키는 등의 불법 행위 등도 빈번하게 나타나고 있다. 이와 같은 실정에도 불구하고, 우리나라 바지락의 고유종 집단에 대한 유전적 다양성이나 분자생태와 관련된 연구는 몇몇에 불과하다. 이처럼 미비한 연구 실정은 국내 바지락의 유전적 연구에 대한 전반적인 문제로서, 국내 바지락 집단 중 어떤 지역 집단이 고유종인지 전혀 파악되지 않고 있으며, 집단 구조와 유전자 흐름에 관한 정보도 얻을 수 없는 상황이다. 따라서 바지락과 같은 중요한 양식 대상 종에 대한 이해부족으로 인해 효율적인 보전 및 관리에도 문제점이 나타날 것이다. 본 연구에서는 생태 및 집단유전학 연구에 있어 널리 사용되고 있는 분자마커인 단일염기다형성 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커와 초위성체 (Microsatellite) 마커를 이용하여 국내 바지락 집단의 유전적 다양성, 집단의 구조와 집단 사이의 유전적 분화 등의 집단유전학 연구를 수행하고, 이를 바탕으로 응용하여 국내산과 수입산 바지락을 구별할 수 있는 새로운 SNP 마커를 개발하였다. 또한 바지락 집단 분석을 통해 단일염기 다형성과 고변이유전자 마커의 효율성을 비교하고자 하였다. 최근 많은 생물체에서 발현유전자 조각 (EST: expressed sequence tag)의 분석으로 유전자 발현양상에 대한 많은 연구가 실행되고 있으나 바지락과 같은 패류에 대한 EST 자료는 몇몇 종에 불과하다. 본 연구는 바지락 6개체의 5조직 (아가미, 신장, 비장, 간, 근육) 으로부터 Next Generation Sequencing을 수행하여 약 160K의 염기서열 (평균 read length: ~400)을 확보하였다. 바지락의 주요 조직으로부터 확보된 780,000개의 EST를 분석한 결과 46,405의 consensus와 200,048의 singleton을 얻었으며, BLASTX를 수행하였으나 현재 연체류의 밝혀진 단백질 서열이 많지 않아 homology based annotation을 수행했을 때 상당 부분 "UNKNOWN"으로 나타났다. 국내 바지락 집단의 종 보존과 관리를 위한 유전적 다양성 및 집단 구조 분석을 위해 국내 바지락 9 집단과 수입산 바지락 1집단에서 EST 유래의 초위성체 마커 10개를 개발하였다. 유전적 다양성 분석 결과 평균 대립유전자수는 6.48개이며, heterozygosity의 관측치 (Ho)와 기대치 (He)는 각각 0.410과 0.547을 나타내었다. 집단 간 분화정도를 나타내는 FST 값은 0.081로 중간정도의 유전적 분화정도를 나타냈다. STRUCTURE 분석과 PCA 분석 결과, 10개의 바지락 집단은 유전적으로 2 집단 (K = 2)으로 구성되어 있었으나, 유전자형의 분포로 볼 때 3개의 그룹으로 구분되는 것을 알 수 있었다 (바지락 수입산 집단, 우리나라 서해 집단과 남․동해 집단). 따라서 바지락 집단이 지역별로 차이가 나타남을 확인 할 수 있었다. 국내 바지락 집단 구조의 유전적 연구를 위해 EST로부터 28개의 단일염기다형성 마커를 개발하였다. 초위성체 마커와 마찬가지로 국내 바지락 9 집단과 수입산 바지락 1 집단을 대상으로 분석하였다. 평균 대립유전자수는 1.996개이며, heterozygosity의 관측치 (Ho)와 기대치 (He)는 각각 0.364와 0.410을 나타내었다. 집단 간 분화정도를 나타내는 FST 값은 0.101로 다소 높은 유전적 분화정도를 나타냈다. STRUCTURE 분석과 PCA 분석 결과, 10개의 바지락 집단은 유전적으로 3개의 집단 (K = 3)으로 구성되어 있었으며, 바지락 수입산 집단, 우리나라 서해 집단 그리고 남․동해 집단으로 명확한 지역별 차이를 나타내어 바지락 집단이 지역별로 차이가 나타남을 확인 할 수 있었다. 위의 두 연구 결과를 바탕으로 하여, 국내산 바지락을 보호하고 불법 행위를 근절시키며 안정성을 보장하기 위한 일환으로 수입산과 국내산 바지락의 원산지 판별이 가능한 EST 유래의 새로운 21개의 단일염기다형성 마커를 개발하였다. 이들 21개의 SNP 마커는 98.96%의 정확도 (Geneclass 2.0 프로그램 사용)를 나타내어, 우리나라의 원산지 표시제와 수입산과 국내산 바지락을 구별이 필요한 여러 분야에 활용이 가능 할 것이라 사료된다. 이와 같은 결과는 수입산 바지락 집단과 국내산 바지락 집단이 유전적 차이가 있음을 나타내며, 국내 바지락 집단 간에도 해역별 (서해-남․동해) 차이가 나타남을 알 수 있었으며, 특히 단일염기다형성 마커를 통한 분석에서는 초위성체 마커보다 명확하게 집단이 구분 되는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해서 초위성체 마커는 집단의 유전적 다양성 분석에 유용하고, 단일염기다형성 마커는 집단 간의 유전적 구조 분석에 용이하다는 사실을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 분자마커인 Microsatellite 및 SNP 마커는 국내 바지락 집단의 유전적 다양성을 평가 및 분석하거나 집단구조를 평가하는데 유용하게 사용될 것이며, 이러한 자료를 바탕으로 바지락 자원의 증강 및 보전 등에 폭넓게 활용될 수 있을 것이라 기대한다.