Antibiofilm Effects of Oligo-chitosan Compounds against Biofilm-forming Pathogenic Bacteria

Abstract

바이오 필름 (Biofilm)이란, 미생물들이 표면에 세포들이 서로 부착된 것을 말하며 ‘생물 막(生物膜)’ 이라고도 한다. 바이오 필름은 식품, 질병(식중독)뿐만 아니라 정수기, 상하수도, 산업용 배관, 공기 정화시설, 생활용품 등 모든 종류의 인공적인 시설물 표면에 미생물들이 부착하면서 형성된다. 특히, 인공장기 같은 의, 치과 의료기구, 각종 삽입 보형물 (implant)등 에서 미생물들은 활발히 바이오 필름을 형성하고 그로 인해 우리 몸에 질병을 발생시키게 된다. 그 뿐만 아니라 세탁기, 에어컨, 가습기를 포함한 생활가전 그리고 배수구 등 우리의 일상생활에서 넓고 다양하게 심각한 문제를 일으키고 있다. 바이오 필름은 여러 단계를 통해 복잡한 과정으로 형성된다. 바이오 필름이 생성되는 과정 중 박테리아들은 자기 생장에 있어 불리한 환경에 처할 경우, 환경에 적응하기 위해 quorum sensing을 이용하여 여러 가지 신호 물질을 생성하고 그 주위에 세포 밖 고분자 물질인 extracellular polymeric substance (EPS)를 생산한다. EPS는 고분자 복합체로써 세포 외부의 유전자, 단백질, 다당류로 이루어져있다. 이렇게 형성된 EPS는 바이오 필름의 3차원구조와 전반적인 골격을 구성하며 미생물 집단을 더욱 단단하고 끈끈하게 한다. EPS에서 자라는 미생물 균체들은 생리학적으로 액체 배양액에 떠다니거나 헤엄치는 플랑크톤의 단일 세포와는 구별된다. 바이오 필름의 문제점은 미생물 막(biofilm) 내의 세균들이 부유 상태의 세균(planktonic bacterial cells)보다 항생물질에 대한 내성이, 적게는 10배에서, 많게는 1,000배 이상 높아져 기존에 알려진 항생제로는 치료하기가 어렵다는 것이다. 생체 이외에서도 바이오 필름은 여러 가지 항생제나 살균제로부터 더 큰 저항성을 가지며 끈끈한 밀착력 때문에 살균과정에서 제거되지 않는다. 이로 인해 다른 식품과 직ㆍ간접적인 접촉으로 2차 오염을 야기하며 공중위생에 심각한 문제를 초래할 수도 있다. 또한 병원성 균에 의한 교차오염뿐만 아니라 부패 균에 의한 오염으로 식품에 심각한 영향을 줄 수 있기 때문에 바이오 필름의 제거가 반드시 필요하다. 바이오 필름을 잘 생성하는 대표적인 병원성 균들은 Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus가 있다. 이 병원성 균들을 대상으로 바이오 필름을 저해하기 위한 많은 연구가 진행 중이다. 본 연구에서는 항균, 항산화, 항염증 효과를 포함한 생리활성 등의 효과가 있다고 보고된 천연 해양물질인 chitosan과 이를 저 분자화 시킨 분자량이 다른 oligo-chitosan을 이용하여, 바이오 필름을 형성하는 병원성 균인 P. aeruginosa, L. monocytogenes, S. aureus를 대상으로 바이오 필름의 생성 저해 및 억제 효과를 측정하였다. 먼저 일반 부유균에 대한 항균 활성을 측정하기 위해, minimum inhibitory concentration (MIC) 와 minimum bactericidal concentration (MBC) assay를 이용하였다. 그 결과는 전반적으로 대조구인 chitosan보다 저 분자화시킨 분자량 1-3 kDa 인 oligo-chitosan이 뛰어난 활성을 나타내었다. 전체적으로는 oligo-chitosan의 분자량에 따라 유사한 항균 효과를 나타내었지만 oligo-chitosan분자량이 커질수록 효과는 감소하였다. 특히 실험에 이용된 식중독 균 중 L. monocytogenes가 가장 우수한 항균 활성을 나타내었고, 그 다음으로 P. aeruginosa와 S. aureus 가 항균활성을 보였다. Chitosan과 oligo-chitosan의 antibiofilm 활성 측정 실험은 병원성 균들에 의해 형성된 바이오 필름에 대한 chitosan과 oligo-chitosan의 바이오 필름 저해 효과를 파악하기 위한 실험이다. 실험방법은 biofilm inhibitory concentration (BIC)와 biofilm eradication concentration (BEC) assay를 진행하였고, 균의 종류와 물질에 따라서 항균 활성과 그 경향이 유사하였다. 또한 형성된 바이오 필름을 저해하는데 요구되는 Chitosan과 oligo-chitosan의 농도는 일반 부유균을 저해하는데 요구되는 값보다 최소 2배에서 최대 16배 높은 값을 나타내었다. 다음으로 chitosan과 oligo-chitosan이 바이오 필름 형성을 얼만큼 억제하는지 파악하기 위해 MIC의 농도 보다 3단계까지 낮은 sub-inhibitory concentration(sub MIC) 에서 (0.5 MIC, 0.25 MIC, 0.125 MIC) 형성된 바이오 필름을 염색하는 safranin stain assay를 진행하였다. Sub-MIC 농도(0.5 MIC, 0.25 MIC, 0.125 MIC)에서 safranin으로 염색된 바이오 필름은 chitosan과 oligo-chitosan이 바이오 필름 형성을 얼마나 효과적으로 억제하였는지 알 수 있다. Safranin stain assay에서 TSB배지를 사용했을 때 샘플농도가 적어질수록 바이오 필름형성이 저해되어야 하는데 반대의 현상이 나타나는 문제점이 있었다. 이러한 이유는 chitosan과 배지의 어떠한 성분이 결합반응을 하면서 나타나는 현상으로 추정되고 또한 chitosan농도가 희석되면서 배지의 ph변화로 인해 chitosan가루가 well plate바닥에 가라앉는 현상이 나타난 것으로 추정된다. 이러한 문제점들을 개선하고자 MHB배지를 썼을 때 chitosan이 가라앉는 현상이 적게 나타났으며 MIC값도 더 효과적으로 나타났다. TSB배지를 MHB배지로 바꿔서 가장 우수한 항균 활성을 보인 L. monocytogenes에 대해 초점을 맞추어 safranin stain assay을 진행하였다. 종합적으로 병원성 균들의 일반 부유균 보다 바이오 필름이 가지는 항생물질에 대하여 증가된 저항성을 알 수 있었다. 이에 대한 원인은 균의 종류마다 각기 다른 메커니즘으로 바이오 필름의 형성이 이루어지기 때문이며 또한 항생물질에 대한 반응과 바이오 필름을 형성하는 구성 성분 및 구조가 다르기 때문으로 추정된다. 본 연구의 결과를 통해 oligo-chitosan이 항균, 항염증, 항암 활성뿐만 아니라 L. monocytogenes 바이오 필름에 대한 뛰어난 항균활성을 나타내는 것으로 판단된다. 향후, 항균 활성을 가지는 천연 유래 기능성 물질로서 올리고 키토산이 바이오 필름을 생성하는 병원성 균 제어에 유용하게 이용 되어 질 것으로 생각된다.