Megalocytivirus의 in vitro 배양특성과 vaccine 개발
- Abstract
- 어류에서 질병을 유발하는 여러 병원체 중 megalocytivirus는 우리나라를 비롯한 세계 각자의 해산어 및 담수 양식산업에서 해마다 경제적으로 큰 손실을 일으킨다. 하지만 현재 megalocytivirus에 대한 연구는 부족한 실정이며, 예방책으로 생각되는 백신개발 역시 아직 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 본 연구는 megalocytivirus 감염 시 돌돔과 참돔의 면역반응의 차이를 비교함으로써 두 어종의 감수성의 차이를 밝히고 백신개발을 통해 megalocytivirus 예방대책에 중점을 두고 연구를 수행하였다. Megalocytivirus 감염 시 초기 면역반응에서 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 면역유전자 Mx, IL-1β, IL-8, COX-2 gene을 돌돔과 참돔에서 cloning 하였다. 두 어종의 면역반응을 분석한 결과 Mx gene의 발현이 돌돔에 비해 참돔이 높은 발현을 보여주었다. 본 연구결과를 바탕으로 megalocytivirus 감염 시 Mx protein과 같은 interferon에 의해 유도되는 단백질의 생성이 어류가 바이러스를 이겨내는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다. 백신 개발 및 바이러스 특성 연구에 세포주 개발은 필수적이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 참돔의 지느러미를 이용하여 세포주 개발을 하였으며, PMF cell이라고 명명하였다. PMF cell은 megalocytivirus에 대해 감수성을 보였지만 바이러스의 계대배양은 불가능하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 Serun free medium (SFM)을 사용하였으며, SFM의 사용은 면역을 감소시켜, 기존에 바이러스 계대배양이 불가능했던 PMF, GF 그리고 BF-2의 megalocytivirus 계대배양을 가능하게 하였다. 고농도 megalocytivirus의 획득은 불활화 백신개발에 기본이자 가장 중요한 요소이다. 따라서 megalocytivirus에 감수성이 높은 돌돔자어를 이용하여 세포를 만들었다. RBE (rock bream embryo) cell은 megalocytivirus에 대해 높은 감수성을 보였으며, GF 와 PMF cell보다 약 50배 이상 높은 viral copy number를 보여주었다. 본 연구에서는 RBE cell에서 획득한 고농도 megalocytivirus를 이용하여 다양한 불활화 백신을 제작하였으며, 돌돔에 대해 높은 효과를 확인하였다. 본 연구에서 제작한 고농도 megalocytivirus 백신은 돌돔에 대해 직접적 효과를 입증한 최초의 연구이며, 유전자 조작 없는 불활화 백신으로 보다 안전한 예방책이라 할 수 있을 것이다.
- Issued Date
- 2014
- Awarded Date
- 2014. 2
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Affiliation
- 대학원
- Department
- 대학원 수산생명의학과
- Advisor
- 정현도
- Table Of Contents
- 목 차
ABSTRACT vii
제 1장. 돌돔과 참돔의 선천적면역반응이 megalocytivirus에 대한 감수성에 미치는 영향 1
1. 서 론 1
2. 재료 및 방법 4
2.1. 실험어 4
2.2. 바이러스 4
2.3. 호흡폭발 측정 5
2.4. Viral DNA의 정량 6
2.5. 돌돔과 참돔의 폐사율 비교 7
2.6. 면역 유전자의 cloning을 위한 RNA 분리 7
2.7. 면역 유전자의 전체 염기서열 결정 8
2.8. 면역 유전자의 발현분석 11
2.9. 돌돔과 참돔 자어세포에서 IVS-1의 증식비교 13
2.10. 통 계 13
3. 결 과 14
3.1. 돌돔과 참돔의 IVS-1에 대한 감수성 비교 14
3.2. 돌돔과 참돔의 면역 유전자 염기서열 분석 16
3.3. IVS-1에 의한 돌돔과 참돔 macrophage의 호흡폭발 측정 19
3.4. 돌돔과 참돔의 선천적면역반응 비교 21
3.5. 돌돔과 참돔 자어세포에서의 면역반응 비교 26
3.6. 돌돔과 참돔 자어세포에서의 IVS-1 증식비교 28
4. 고 찰 31
제 2장. 초대 배양된 자어세포에서의 megalocytivirus 배양 및 특성 36
1. 서 론 36
2. 재료 및 방법 39
2.1. 바이러스와 주화세포 39
2.2. 자어세포의 초대 배양 40
2.3. In vitro passage 횟수에 따른 IVS-1의 감염성 변화 41
2.4. RBE cell의 세대수 증가에 따른 감염성 변화 42
2.5. IVS-1 V0와 V1의 돌돔에서 병원성 비교 43
2.6. IVS-1 V0와 V1의 염기서열 분석 43
3. 결 과 44
3.1. 주화세포에서 IVS-1의 배양특성 44
3.1.1. 주화세포에서 IVS-1의 viral passage 44
3.2. 자어세포에서 IVS-1의 배양특성 47
3.2.1. 자어세포의 형태적 특징 47
3.2.2. 자어세포에서 IVS-1의 배양 50
3.2.3. 자어세포에서의 virus passage 53
3.2.4. Subcultured 자어세포에 대한 IVS-1의 감염성 55
3.3. In vitro pasasged IVS-1 의 특성 분석 58
3.3.1. IVS-1 V0와 V1의 병원성 비교 58
3.3.2. IVS-1 V0와 V1의 유전적 비교 58
4. 고 찰 60
제 3장. 참돔 지느러미 유래의 주화세포 확립 및 megalocytivirus에 대한 감수성 증대 65
1. 서 론 65
2. 재료 및 방법 67
2.1. 참돔지느러미세포의 초대 배양 67
2.2. PMF cell의 배양 68
2.3. PMF cell의 염색체수 분석 69
2.4. PMF cell의 증식 속도 분석 69
2.5. PMF cell의 IVS-1 passage 70
2.6. PMF에 대한 SFM 처리 71
2.7. SFM에서의 multi-viral passage 73
2.8. PMF cell의 면역반응 분석 73
3. 결 과 74
3.1. PMF cell의 확립 및 염색체 수 분석 74
3.2. PMF cell의 최적배양조건 결정 78
3.3. PMF cell의 COI gene 염기서열 분석 80
3.4. PMF cell의 IVS-1의 대한 감수성 변화 분석 81
3.5. SFM처리의 최적화 84
3.6. SFM 처리가 PMF의 면역 유전자발현에 미치는 영향 분석 88
4. 고 찰 91
제 4장. 참돔이리도바이러스 감염 예방을 위한 백신개발 95
1. 서 론 95
2. 재료 및 방법 98
2.1. IVS-1 배양 98
2.2. IVS-1의 농축 98
2.3. IVS-1의 감염 조직 homogenate의 조제 99
2.4. IVS-1의 TCID50 및 copy number 측정 99
2.5. 백신의 제조 100
2.6. Vaccination과 공격실험 101
2.7. 백신 투여 어류에서의 면역 유전자 발현 101
2.8. Enzyme-linked immunosorbent assay 102
2.9. 중화반응 103
3. 결 과 104
3.1. RSIVD vaccine의 효과 검증 104
3.1.1. 백신 농도 104
3.1.1.1. 배양된 IVS-1의 titer 및 copy number 측정 104
3.1.1.1. 조직별 감염 IVS-1의 농도 비교 105
3.1.2. 백신 투여량에 따른 효과검증 109
3.1.3. 제조방법에 따른 백신효과비교 111
3.1.4. 백신 투여 기간에 따른 효과비교 113
3.1.5. Viral dose가 백신의 효과 분석에 미치는 영향 115
3.1.6. 백신의 cross protection 분석 119
3.1.7. 백신의 stability 분석 119
3.1.8. 감염 조직의 백신화 가능성 분석 122
3.1.9. 공격 실험 후 생존한 어류에 대한 재공격실험 122
3.1.10. 백신 접종 어류의 IVS-1에 대한 감염성 분석 125
3.2. 백신 투여가 돌돔의 면역 체계에 미치는 영향 127
3.2.1. 백신 투여 시 돌돔의 초기 면역 반응 변화 분석 127
3.2.2. 공격실험후의 생존어가 나타내는 IVS-1에 대한 면역반응 130
3.2.3. 백신 투여 어류의 특이 항체가 분석 132
3.2.4. 백신 투여 어류의 중화 항체가 분석 132
4. 고 찰 135
요 약 144
감사의 글 146
참 고 문 헌 147
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