Differences in virulence and drug sensitivity of different Miamiensis avidus isolates and effects of RNA interference-mediated knock-down of a cysteine proteinase on the ciliate growth

Abstract

양식 넙치 (Paralichthys olivaceus) 에서 발병하는 주요 기생충성 질병 중 하나인 스쿠티카증을 일으키는 Miamiensis avidus는 최근 연구에서 혈청형에 따라 특이적인 병원성을 나타낼 뿐만 아니라 혈청형이 유사할 지라도 다른 장소에서 분리된 분리주에 따라서도 다른 병원성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 이번 실험에서는 각각 다른 양식장에서 분리한 M. avidus의 3가지 분리주 (분리주 1~3) 를 사용해 in vivo 병원성과 약물 감수성의 차이에 대해 분석하였다. 분리주 3을 침지 감염시킨 넙치 치어는 분리주 1 혹은 2를 침지 감염시킨 넙치보다 훨씬 높은 폐사율을 보였으며, 넙치 혈청에 대한 충의 저항성 분석에서도 분리주 3이 가장 높은 저항성을 나타냈다. 또한 M. avidus가 병원성을 나타내는데 결정적인 역할을 한다고 보고된 cysteine proteinase의 분비 활성을 분석 하였을 때도 분리주 3이 가장 높은 값을 나타냈다. 추가적으로 cysteine proteinase 억제제인 E-64를 처리한 후 넙치 혈청에 대한 저항성을 분석하였을 때 모든 분리주의 저항성이 크게 감소된 것을 관찰하였으며, 이는 결과적으로 M. avidus의 cysteine proteinase 는 충이 숙주에게 병원성을 나타내는데 중요한 역할을 하고 있다는 보고를 뒷받침하는 결과이다. 따라서 이 cysteine protein-ase를 억제시키는 것으로 M. avidus의 병원성을 약화시킴으로 스쿠티카충에 의한 피해를 줄일 수 있다는 가정으로 다음 실험을 접근하게 되었다. 하지만, cysteine pro-teinase분비 활성이 큰 차이가 없었던 분리주1과 분리주 2가 혈청 저항성과 in vivo 병원성 분석에서 분리주 2가 상대적으로 높은 저항성과 병원성을 가지는 결과를 관찰하였다. 이는 cysteine proteinase가 병원성 결정에 중요한 역할을 하지만 그 이외에도 다른 인자들이 충의 병원성 결정에 관여함을 시사하였다. 또한3가지의 스쿠티카 분리주는 기생충성 질병치료제인 mebendazole과 bithionol에 대한 약물 감수성의 차이를 나타냈다. 비록 스쿠티카증에 대한 효과적인 약물 개발이 지금까지 전무하지만, 차후 효과적인 화학치료제를 개발하기 위해서는 분리주에 따른 약물 감수성 또한 고려해야 할 요소임을 알 수 있었다. 앞서 실험을 통해 관찰한 M. avidus 병원성과 cysteine proteinase의 관계를 기반으로 RNA간섭을 통해 충의 cysteine proteinase의 발현을 억제시키고 이것이 충의 성장에 미치는 영향을 분석하였다. RNase III knock-out Edwardsiella tarda 영양요구성 돌연변이체를 cysteine proteinase를 억제하는 긴 이중 가닥 RNA를 생산하는데 사용하였고, 이를 M. avidus 분리주 3에 먹이로 사용하여 RNA를 충으로 전달하였다. 조작된 E. tarda를 섭취한 충에서는 cysteine proteinase 유전자가 전사되는 양이 큰 폭으로 감소되었으며, cysteine proteinase 분비 활성 또한 큰 폭으로 감소되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 RNA간섭에 의한 cysteine proteinase의 발현 억제는 충의 증식 또한 감소시키는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들은 cysteine pro-teinase가 M. avidus에 대한 치료 및 예방을 위한 백신의 잠재적인 표적으로 사용될 수 있음을 나타냈다.