Molecular characterization of pattern recognition receptors (PRRs); Toll-like receptor 5 soluble form in the olive flounder (Paralichthys olivaceus)

Abstract

어류는 진화상 첫 번째 척추동물로 포유류의 면역시스템과 공통점이 있지만 서식지와 생리활성이 틀리기 때문에 차이점도 존재한다. 어류는 수생환경에 서식하면서 다양한 병원균에 노출되어 있기 때문에 선천적 면역시스템이 매우 발달해 있다. 본 연구는 어류의 급성면역에 관련된 분자들을 알아보기 위한 것으로 chapter1에서는 Edwardsiella tarda 균을 감염시킨 넙치에서 유전자 발현양상을 microarray로 비교하여 병원균 감염 시 어류의 초기 급성기 반응에 관련된 유전자를 알아보았다. E.tarda 균을 감염시킨 넙치에서catechol-O-methytranferase domain containing1 (COMTDC1), Toll-like receptor 5 soluble form (TLR5S), metaloreductase STEAP 4, Haptoglobin 유전자의 발현이 증가하였다. 특히 TLR는 외부의 병원균 감염을 인지하고 면역세포에 신호전달을 하는데 매우 중요한 receptor로 알려져 있기 때문에 TLR가 어류의 초기 면역반응에 중요하게 작용할 것이라 생각하였다. 특히 어류에서TLR4와TLR4 신호 전달에 관련된 accessory (LY96, CD14), adapter (TICAM2) molecule이 보고되지 않았으며 선행 연구결과 높은 농도의 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리했을 때 면역세포에 자극이 있었다. 이는 넙치의 경우 endotoxin shock를 일으키는 LPS에 대한 저항성이 있으며 수생환경이라는 특이적인 조건 때문에 넙치의 면역시스템 활성화는 LPS 인지하는 TLR4 외에 다른 receptor 에 의해 일어날 것이라 생각할 수 있다. 특히 TLR5는 병원균의 운동성을 담당하는 편모 단백질인 flagellin을 인지하여 면역세포를 활성화 시킨다고 알려져 있기 때문에 넙치의 면역활성화는 TLR5를 통해서 일어날 것이라 가정하였고 넙치 TLR5를 중심으로 어류의 면역 메커니즘을 연구하였다. Chapter 2에서는 넙치 EST 분석과 microarray분석으로부터 얻어진 TLR5는 membrane form과 soluble form의 분자생물학적 동정을 수행하였다. 넙치의TLR5 membrane form (TLR5M) 유전자는 총 6,716bp로 6개의 엑손과 5개의 인트론으로 구성되어 있었으며 세포 내 신호 전달을 담당하는 TIR 도메인을 포함하고 있었다. 그러나 TLR5 soluble form (TLR5S) 유전자는 세포 내 신호 전달 도메인, TIR 도메인이 없이 총 2개의 엑손과 1개의 인트론이 3,868bp에 암호화되어 있었다. TLR5S 유전자는 사람이나 포유류에는 존재하지 않으며 양서류와 어류에만 존재하며 현재는 그 기능에 대해 알려진 것이 거의 없다. TLR5S이 어류의 면역메커니즘에서의 의미와 기능을 알아보기 위해 chapter 3에서는 TLR5S의 프로모터 분석과 어류 세포에 형질전환 실험을 수행하였다. 넙치의 TLR5M과 달리 TLR5S 유전자의 프로모터 영역에는 2개의 AP-1, C/EBP, 1개의 NF-kappaB 전사조절단백질의 결합부위가 존재하였다. 이러한 전사조절단백질들은 염증반응에 관여하는 cytokines 및 면역인자의 발현 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 TLR5S이 병원체 감염에 의한 염증반응에 관여하고 있음을 의미한다. 이들 전사조절단백질 및 내독소가 TLR5S 유전자의 발현에 미치는 영향을 luciferase assay 법으로 확인하였다. 그 결과 NF-kappaB의 subunit인 p65단백질 및 flalgellin의 존재 하에서 TLR5S 프로모터의 활성이 가장 높았으며, NF-kappaB 결합부위가 변형된 경우, 발현이 급격히 감소됨을 볼 때 넙치 TLR5S 유전자의 발현은 NF-kappaB와 flagellin에 의해 조절됨을 알 수 있었다. 어류의TLR5S의 세포 내 발현 위치를 확인하기 위해 넙치 embryo cell 유래의 HINAE 세포를 TLR5S 과다발현세포로 형질전환 하였다. 그 결과 TLR5S 유전자가 과다발현 된 HINAE세포의 세포질의 특정부위에서 TLR5S 발현을 확인할 수 있었다. TLR5S와 TLR5M 유전자의 기능을 알아보기 위해 embryo cell 유래의 HINAE 세포를 TLR5S, TLR5M 발현이 억제된 세포로 형질전환 하였다. 특히 TLR5M이 억제된 세포에서 Flagellin에 의해 발현이 증가하는 IL-8, MAPK, TNF-α 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. TLR5S이 억제된 세포에서 TLR5M과 TNF-α 유전자 발현이 감소되었다. 이 결과는 TLR5M 의 신호전달에 TLR5S 유전자가 시너지 작용을 한다고 볼 수 있다. 요약하면 넙치의 면역활성화에 LPS보다 Flagellin이 중요하게 작용하고 있으며 이 과정은 패턴인지수용체 중 TLR5를 통해서 이루어졌다. 병원균은 수생환경에서 운동성을 확보하기 위해 flagellin 같은 물질을 증가시켰고, 어류는 이를 인지하기 위해 TLR5M, TLR5S 과 같이 다양한 형태로 면역인자들을 진화시켰을 것이라 생각해 볼 수 있다. 이 결과를 바탕으로 병원균의 감염 시 넙치에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 정보를 확보하고 특성을 연구함으로써 경골어류의 면역학의 유용한 정보로 이용될 뿐만 아니라 향후 내병성 넙치의 품종 개발을 통해 넙치 양식에 밑바탕이 될 것으로 기대 된다.