두족류 특이적 프라이머를 이용한 한국해역에 서식하는 두족류 플랑크톤 연구

Abstract

Although studies on the paralarva of cephalopods provide the useful information for their effective management, their analysis has been difficult mainly due to their low numbers in the mixed zooplankton net samples and difficulties in the species identification. In order to overcome the difficulty in their study, we here designed a cephalopod-specific (CPD) universal primer set targeting mitochondrial cytochrome b and ND6 genes as the result of multiple alignment of 34 complete cephalopod mitochondrial genome sequences in the GenBank database. The amplicon sizes (465 – 471 bp) by CPD primer set were designed to optimize for the MiSeq system (Illumina). The reliability of the CPD primer set was tested with the zooplankton samples collected from Korean waters in 2016. As the result of NGS, cephalopod sequences were exclusively obtained with little contaminant sequences from other mixture of zooplankton samples. Among the analyzed total OTUs, Watasenia scintillans, Todarodes pacificus and Sepiola birostrata were among the most frequently identified species in Korean waters at 99 % nucleotide sequence identity as cutoff value. Meanwhile, 11 % of the total contigs showed less than 90 % identity to the currently deposited GenBank database and they were classified as ‘unidentified’ suggesting the necessity for database supplementation. We also identified that the genotypes of T. pacificus in November was clearly distinct from those in other months indicating different population. Those results showed that a large scale paralarvae surveys can be possible with relatively low cost and efforts for the analysis, which should provide a better information of the cephalopod plankton ecology for their scientific management.

두족류 유생 분석은 자원의 효과적인 관리를 위한 중요한 정보를 제공하지만, 이에 대한 연구는 주로 적은 유생의 양과 형태학적 식별의 어려움으로 인해 활발히 수행되지 못했다. 우리는 34종의 두족류 미토콘드리아 서열을 다중 정렬하여 cytochrome b와 ND6 유전자를 타겟으로 하는 두족류 특이적인 (CPD) 프라이머를 디자인하였다. 디자인한 프라이머는 Illumina Miseq 시스템에 최적화된 길이를 증폭한다. 두족류에 대한 CPD프라이머의 특이성을 알아보기 위해, 2016년 한국 해역에서 채집한 동물플랑크톤 샘플을 이용하여 차세대 염기 서열 분석 (NGS)을 수행하였다. NGS 결과, 우리는 현재 설계된 프라이머 세트의 두족류 특이성을 확인하였으며 이는 혼재된 동물플랑크톤 샘플로부터 선택적으로 두족류 유생을 분석하는데 적합하다는 의견을 뒷받침 하였다. 분석된 OTU 중 Watasenia scintillans, Sepiola birostrata 및 Todarodes pacificus가 한국 해역에서 가장 빈번히 나타났다. 반면, 전체 contig의 11 %가 현재 GenBank에 저장된 데이터베이스와 90 % 미만의 동일성을 보였으며, 이는 ‘unidentified’ 로 분류되었다. 이러한 결과는 데이터베이스의 보완에 대한 필요성을 제시한다. 또한 주요 우점 genus에 대한 월별 대표 genotype 분석을 통해 T. pacificus는 11월의 genotype들이 다른 달과는 뚜렷이 구분되는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과는 CPD프라이머를 이용한 metagenomics 분석으로 대규모의 두족류 플랑크톤 조사가 경제적이고 효율적으로 이루어 질 수 있음을 보여주었으며 이는 자원 관리를 위해 두족류 플랑크톤 생태학에 대한 더 나은 자료를 제공할 수 있다.