Porphyra yezoensis peptide inhibits the metastasis and proliferation of MCF-7 cells

Abstract

김 (Porphyra yezoensis) 펩타이드의 MCF-7 세포 증식 및 전이 억제 작용 메카니즘

박 수 진

부경대학교 대학원 식품생명과학과

요 약

방사무늬돌김 (Porphyra yezoensis)은 그 영양가치 뿐만 아니라 콜레스테롤 저하작용, 향균효과 및 항암효과 등 다양한 생리효과를 가진다는 사실이 밝혀지면서 많은 관심의 대상이 되고 있다. 최근 김에 함유된 생리기능성분을 활용한 고부가가치 기능성식품 소재와 기술개발에 관심을 가지게 되었고 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있지만, 포피란과 같은 단당류와 당단백질 수준에서의 연구만 진행되고 있는 실정이다. 하지만, 김은 약 36%의 많은 단백질을 함유하고 있으나 단백질에 관한 기능성을 연구하는 보고는 거의 없는 실정이다. 뿐만 아니라, 방사무늬돌김으로 부터 분리된 당단백질은 현재 부분적으로 항암의 효능이 밝혀져 있기는 하지만, 펩타이드 수준에서의 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서는 방사무늬돌김으로 부터 분리한 펩타이드를 이용하여 인간 유방암 세포주인 MCF-7 세포의 성장 및 전이억제 메카니즘 기전에 관하여 밝히고자 하였다. MTS assay결과 Porphyra yezoensis의 peptide (PPY)는 인간 유방암 세포 MCF-7의 증식 억제 효과를 나타내었으며, DAPI staining assay에서도 동일하게 농도 의존적으로 세포 사멸을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 인간 유방암 세포주인 MCF-7에서 PPY가 세포증식 억제 효능에 영향을 주고 있을 뿐만 아니라, 형태학적인 변화에서도 PPY가 인간 유방암 세포인 MCF-7에서 apoptosis 유도와 관련되어 있다고 여겨진다. PPY가 세포사멸유도에 관련된 기전을 확인하기 위하여, 먼저, Insulin-like growth factor (IGF-I)와 관련된 세포사멸신호인 AKT 단백질이 농도 의존적으로 감소하며 AKT의 인산화에도 영향을 미치는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, IGF-IR과 ERK의 인산화가 감소함으로써 PPY가 인간유방암세포의 증식억제 효능을 나타내었다. 그리고 mTOR기전 관련 인자를 확인한 결과에서도 mTOR, p70S6K 등의 관련 단백질이 감소함으로써, PPY로 인하여 암세포의 증식억제 효능과, mTOR 관련인자인 p70S6K 와 Tissue transglutaminase2 (TG2) protein의 감소로 인하여 인간 유방암 세포 MCF-7의 전이억제 효과도 확인하였다. 이어서 프로그램화된 세포죽음의 또 다른 형태로써 type Ⅱ라고 불리는 autophagy에 관련인자를 확인함으로써 PPY가 세포 사멸 기전과 관련있음을 보고자 했다. Autophagy 유도시 발현이 증가하는 단백질로써 LC3와 Beclin-1이 있는데, Beclin-1은 autophagosome을 형성하는 중요한 역할을 하며, LC3는 autophagy가 일어나면 LC3의 두 가지 형태 중에 LC3 Ⅰ form이 LC3Ⅱ로 전환되면서 autophagosome의 막에 결합하기 때문에 직접적인 autophagosome의 직접적인 지표가 된다. 본 연구는 PPY 처리에 의하여 apoptosis 뿐만 아니라, autophagy가 동시에 유발됨으로써 확실한 세포 사멸 기전을 보여주고 있는 것으로 확인하였다. Transforming growth factor-β (TGF-β)는 세포들에서 강력한 성장억제제로 작용하고 있으며 실제 apoptosis의 조절에 중요한 역할을 하는 인자로 알려져 있다. 동시에, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)의 발현에 관여함으로써 세포내 migration과 invasion에 영향을 주어 세포의 부착 능력을 억제한다. 본 연구에서는 PPY가 EMT 관련 단백질의 발현을 조절함으로써 세포와 세포 사이 전이를 억제해주는 결과로 보여진다. 본 연구에서는 PPY가 TGF-β1 signal의 억제 확인과 EMT관련 인자의 변화를 확인함으로써 PPY가 인간 유방암 세포내의 성장과 전이 억제에 중요한 key로 작용함을 확인하였다. 동시에 Wnt signal을 확인함으로써, TGF-β1의 발현과 세포와 세포사이의 부착 관련 단백질을 조절하는 결과로 보여진다. 이로써, PPY가 Wnt와 TGF-β1 signal의 발현에 관여함으로써, 인간 유방암 세포 MCF-7의 전이 및 부착 능력을 억제하는 것으로 나타났다. Small interfering RNA (siRNA)는 특정 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하여 그 유전자의 단백질 발현을 억제, 전사단계에서 유전자의 발현을 억제하는 RNA간섭 (RNAi)으로 알려져 있다. 또한 유전자의 이중가닥 RNA (double-stranded RAN, dsRNA)를 세포 내로 주입하는 RNAi는 RNA-induced silencing complex (RISC)나 dicer RNase Ⅲ 같은 세포내 효소들에 의해 그 유전자의 mRNA를 특이적으로 분해하여 유전자의 발현을 억제하는 방법이다. 이들은 ribozyme이나 antisense ODN을 이용하는 유전자 억제방법보다 훨씬 더 효율적으로 목적하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있어 최근 들어 다양한 실험 연구와 치료 방법에 응용되고 있다. 본 실험에서는 target gene을 mTOR과 TGF-β1으로 선택하여 실험하고자 했다. mTOR siRNA와 TGF-β1 siRNA와 Lipofectamin을 사용하여 관련 gene을 knock-down 시킨 후, PPY를 농도별로 처리하여 그 결과를 보고자 하였다. non-target mTOR과 non-target TGF-β1과 비교하였을 시, mTOR siRNA와 TGF-β1 siRNA 처리한 군에서 발현량이 현저히 감소함을 확인하였다. 이는 Target gene의 발현억제를 확인함으로써, mTOR과 TGF-β1 signal에 PPY가 관련 있음을 보여주는 결과이다. 이로써, PPY가 성장 관련 기전인 IGF-IR과 mTOR 관련 단백질을 억제함으로써 세포사멸 경로와 apoptosis가 유도됨을 확인하였고, 동시에 autophagy target인 mTOR과 Atg 단백질을 확인함으로써 autophagy 또한 유도됨을 확인하였다. 이는 PPY가 인간 유방암 세포 MCF-7의 증식 억제에 관여함을 보여주는 결과로 사료되어진다. 그리고 TGF-β1과 Wnt 경로의 억제와 EMT 관련 인자를 확인함으로써, PPY가 인간 유방암 세포 MCF-7의 전이억제에 영향을 줌을 확인하였다. 지금까지의 결과를 통하여 PPY가 MCF-7인간 유방암 세포의 성장 및 전이를 억제하는 것으로 나타났다.