비선택적 제초제 Basta에 노출된 미꾸라지 Misgurnus mizolepis의 병리조직학적 분석 및 전사체 프로파일링

Abstract

Basta herbicide, contains the active gradient of glufosinate ammonium, is widely used as a non-selective herbicide worldwide, and is rising concerns for potential environment and human health impacts. However, there has been no comprehensive investigation in the global molecular mechanism of glufosinate ammonium and Basta’s toxicity for fish species. This study, which has the ultimate goal of analysing the toxicity of Basta includes (1) analysis of acute toxicity and its lethal concentration (LC50) (2) histopathological analysis of gill and liver tissues exposed to subchronic toxicity from Basta (3) global transcriptome profiling of brain, gill and liver tissues from mud loach Misgurnus mizolepis exposed to Basta. From the result of the analysis of acute toxicity, LC 50 values were 14.7 ppm (48 h) and 12.0 ppm (96 h) in larvae, 33.2 ppm (48 h) and 30.8 ppm (96 h) in juvenile, and 43.4 ppm (48 h) and 38.7 ppm (96 h) in sub-adult of mud loach. In subchronic exposure tests, histological changes in gill and liver were evaluated with histopathological indices, allowing the damage quantification of fish which was exposed to different concentrations of Basta. Basta induced different histological alteration in a concentration - dependent manner. Clubshaping, epithelial lifting, and fusion of the lamella was observed in the gill, and lipidic vacuolization of the hepatocytes, nuclear pyknosis, leukocyte infiltration, hydropic degeneration and necrosis was found in liver. In transcriptomics, identifying differentially expressed genes (DEGs) under a given condition was mainly performed by using RNA-seq data. To do this, the brain, gill and liver of mud loach sub adult exposed to 38.7 ppm (96 h) of Basta was used. The RNA sequencing data was generated by using the main equipment of next generation sequencer (Illumina HiSeq 4000 NGS platform). After the NGS analysis was completed, Clustering and assembly were performed with unigene by using the de novo assembly program Trinity and CD-HIT-est. Annotation was performed by using the Blast2Go program through the NCBI nr DB, KOG DB, GO, and KEGG databases. As the result of sequencing, total of 59,666,606 raw reads of brain in control, 76,898,472 raw reads of brain in experimental group, 71,834,144 raw reads of gill in control, 62,847,956 raw reads of gill in experimental group, 53,836,300 raw reads of liver in control, and 62,803,310 raw reads of liver in experimental group were produced. As the result of trimming, assembly and clustering, 138,239 unigenes (average length of 764.9 bp) of brain in control, 157,017 unigenes (average length of 744.6 bp) of brain in experimental group, 104,035 unigenes (average length of 695.9 bp) of gill in control, 107,232 unigenes (average length of 606.9 bp of gill in experimental group, 82,805 unigenes (average length of 736.4 bp) of liver in control, 122,321 unigenes (average length of 668.5 bp) of liver in experimental group were generated. Using the BLASTX program, sequences were blasted against NCBI nr, GO, KEGG and KOG databases. This process successfully annotated 77,081 unigenes (32.43%) in brain, 61,952 unigenes (37.45%) in gill and 76,169 (42.84%) in liver in NCBI nr databases. Total 18,004 unigenes (7.77%) in brain, 15,245 unigenes (9.22%) in gill, 16,949 unigenes (9.53%) in liver were annotated in KEGG. Analysis results in Egg NOG DB, 32,487 unigenes (13.6%) in brain, 27,128 unigenes (31.9%) in gill, 28,468 unigenes (16.01%) in liver were matched. GO terms were assigned to the predicted M. mizolepis genes to classify their function. Blast2GO successfully annotated 64,822 unigenes (27.27%) in brain, 52,693 unigenes (31.85%) in gill and 65,288 unigenes (36.72%) in liver according to the three main GO classifications (BP, biological process; CC, cellular component; MF, molecular function). An overview of the number and ratio of assigned genes related to a specific term was provided by GO annotation. In the GO analysis of brain, unigenes involved in cellular process (GO:0009987, 15.6%) were most represented for the biological process. Regarding to the molecular function, binding (GO:0005488,45.6%) was the most represented, followed by catalytic activity (GO:0003824, 28.3%). Genes related to the cell (GO:0005623, 19.9%) and cell part (GO:0044464, 19.8%) were highly represented for the cellular component. TRLs, IRFs, ILs, CCLs, TNF, STAT1, fos, MYD88 and RAC1 genes related to toll-like receptor pathway of innate immune system were differentially expressed. Also, CASPs, IKBKG, STATs, IL3 and FADD genes related to TNF, MAPK and NF-κB signaling pathways in apoptosis were differentially expressed. Various genes related to arginine, proline, alanine, aspartate, glutamine, serine and threonine metabolism pathways and TCA cycle were differentially expressed in liver. These results will be used for good biomarker to health condition analysis of freshwater fish in paddy field, stream and river that in natural environments contaminated with Basta. Also, global transcripts profiling data will be used to evaluation of gene expression and early warning system to monitoring of fishes exposed to herbicide.

전 세계적으로 오랜 기간 동안 무비판적으로 농약을 사용해 왔다. 화학비료와 제초제를 이용하여 작물을 재배하는 경우 서식 생물들의 생식 호르몬의 불균형뿐만 아니라 대사장애를 일으킨다. 생태계에 직접적인 영향을 미쳐 다양한 생물종의 항상성에 치명적인 원인이 된다(Grisolia, 2005). 농화학 약품은 플랑크톤의 종 구성에 영향을 미치고 이에 따라 어류 군집 변동을 야기한다. 따라서 직간접적인 영향을 받는 대표적인 수서생물 지표종은 어류이다(Kime, 1995). 담수생태계는 농약의 침출, 유출 및 직간접적인 살포나 바람의 영향에 따라 오염되고 있다(WHO, 2005). Grisolia (2005)와 Udroiu (2006)는 대규모 농장에서 대량으로 사용하는 농약은 생물 다양성의 감소에 직접적인 관련이 있다고 하였다. 이는 돌연변이율의 증가와 함께 민감한 유전자형이 제거됨으로써 환경변화에 적응할 수 있는 잠재력을 감소시키고 유전적 부하를 증가시킬 수 있다. 유엔식량농업기구(FAO)가 발간한 식량전망(Food Outlook) 보고서에 따르면 2017년 전 세계 쌀 생산 예상량은 50,260만톤이다(FAO, 2017). 세계 최대 쌀 생산국은 중국으로, 전년보다 0.4% 증가한 14,230만톤을 생산할 것으로 전망됐다. 2∼5위는 인도 11,040만톤, 인도네시아 4,660만톤, 방글라데시 3,480만톤, 베트남 2,860만톤이다. 우리나라의 쌀 생산량은 이집트 420만톤과 비슷한 수준이다(FAO, 2017). 제초제 사용에 따라 쌀 생산이 증가되어 왔지만 인근수역의 오염, 생산경비의 증가, 제초제에 대한 내성을 가진 해충의 진화 등의 결과를 초래할 수도 있다(Settle et al., 1996; Yoo et al., 2002; Köck et al., 2010). 우리나라 경작지의 50% 이상은 논으로 이곳에서 생산되는 쌀은 주요 농작물이다. 한국의 쌀 자급률은 2014년 95.7%에 이른다. 최근 몇 년 동안 화학비료와 제초제 사용량은 감소하며 친환경 농법은 2000년도부터 빠르게 증가해왔다. 전통농법은 엄격한 환경과 동물복지 규칙에 따라 증가해왔으며 이는 통합농법과 같은 새로운 접근과 방법론의 발달을 의미한다(Ojeniyi, 2000). 농약의 과도한 사용에 따른 물의 오염으로 인해 어류 폐사율이 증가하지만 낮은 농도의 영향에 대해서는 대부분 잘 알려지지 않고 있다. 생태독성에 대한 개체의 생존, 성장과 생식은 실험실 수준의 연구들로 진행되고 있다(Oost et al., 2003). 우리나라에서 수서생물 지표종을 이용한 생태계 건강성 평가는 대부분 하천이나 호수를 대상으로 진행되었으며 농업지역의 수생태계 건강성 평가에 관한 연구는 미비한 실정이다(김 등, 2012). 제초제에 대한 어류의 독성 평가는 소형어류를 대상으로 진행된 바 있다. Butachlor의 송사리 Oryzias latipes에 대한 독성시험(박 등, 2007), molinate의 송사리에 대한 만성독성 영향(박 등, 2006)이 연구되었다. 또한 Shim and Self (1973)는 제초제인 PCP (pentachlorophenol)는 논에 서식하는 송사리와 피라미에 강한 독성을 가지는 것으로 보고하였다. 논에 살포된 농약의 활성성분이 물에 녹아 하천이나 호수에 유입될 수 있으므로 벼 재배용 농약 사용량이 전체 사용량의 50% 정도인 우리나라에서는 농약이 수서생물에 미치는 영향은 매우 크다(정과 박, 1990). 따라서 국내 벼 재배용 농약의 등록 시 미꾸리에 대한 급성독성 시험성적을 반드시 제출하도록 하고 있다(농촌진흥청, 2002). 벼를 재배하는 논에서 직접 수도용 농약은 종류에 따라 차이가 있지만 약 10~55% 치사율을 보이는 것으로 나타났다(박 등, 2003). Basta는 현재 전 세계 80개국 이상에서 판매되고 있으며, Basta, Rely, Finale, Ignite, Challenge 및 Liberty라는 상품명으로 판매되고 있다(Shaner, 2000; Jewell and Buffin, 2001; Shipitalo et al., 2008). Basta의 원료인 glufosinate ammonium은 phosphynic acid 계의 1년생 및 다년생 잡초에 대하여 비선택적 비휘발성 제초제로서, 방선균 두 종으로부터 분리한 자연독소로 유기 인산계의 아미노산이다(Ferreira Nunes et al., 2010). Glufosinate ammonium은 식물체 내에서 glutamine synthetase를 억제하여 암모니아를 생성하게 되고 이는 광합성 및 광호흡을 억제하여 단백성분을 고갈시켜 식물체의 고사를 유발한다(Wendler and Wild, 1990). 그러나 동물의 경우 암모니아의 세포 내 축적이 전적으로 glutamine synthetase에 의존하지 않기 때문에 중독에 대한 영향은 적다(백 등, 2005). 또한 동물 중추신경계 조직에서 glutamine synthetase와 glutamate decarboxylase도 억제한다(Lacoste and Mansour, 1985; Fushiya et al., 1988; Logusch and Walker, 1989; Ebert and Leist, 1990; Hack et al., 1994). 이는 glutamate의 증가를 초래하고 이런 과도한 glutamate의 분비는 신경세포를 파괴하는 것으로 알려져 있다(Collingridge and Lester, 1989). Watanabe and Santo (1998)은 glufosinate ammonium이 glutamate의 구조적 유사체라는 점에 착안하여 glufosinate가 내인성 glutamate의 신경 전달 기능을 경쟁적으로 방해하여 신경학적 증상을 발생시킬 가능성이 있음을 제시하였다. 다른 연구들은 glufosinate ammonium이 중추신경계의 glutamate 수용체 중 NMDA (N-methyl-D- asparatate) 수용체에 결합하여 산화질소 생성을 촉진하므로 신경세포의 괴사에 관여한다고 보고하고 있다(Michel and Agid, 1995; Nakaki et al. 2000). 아울러 rat을 대상으로 실험한 연구는 활성성분인 glufosinate ammonium보다 계면활성제, 전착제 등 다른 성분을 포함하고 있는 Basta가 더 높은 독성을 가진다는 결과를 보고하였다(Koyama et al, 1997). Basta는 2016년 기준 우리나라 비선택성 제초제 시장의 1/3을 차지하며 Roundup과 함께 시장을 양분하고 있다(한국작물보호협회, 2017). 제조사의 Basta 사용 매뉴얼에 의하면 잡초 제거를 위해서 60∼133 ml/20 L의 농도(3,000∼6,650 ppm)로 경작지 또는 논둑에 직접 살포하는 것을 권장하고 있다(Bayer crop science, 2018). 이는 Basta에 대한 무지개송어 LC50 (96 h)는 34 mg/L로 제시하고 있어, 잡초 제거용 Basta 권장량이 무지개송어 LC50의 88.2∼195.6배 높은 농도이다(U.S. EPA, 1986, 1990b). 비선택성 제초제에 대한 독성평가 모델로 어류를 이용한 연구는 세계적으로 가장 많이 사용되고 있는 glyphosate (Roundup)에 대해 진행되었다. Jiraungkoorskul et al. (2002)은 틸라피아를 대상으로 glyphosate에 아만성 독성 실험 결과 아가미 새엽은 이상 증식하였으며, 새판은 비대해지거나 협착되고, 동맥류가 관찰되었으며, 간세포가 공포화되거나 핵응축이 나타났다고 보고하였다. 또한 glyphosate formulation (Roundup)에 노출된 onesided livebearer, Jenynsia multidentata에 대한 간과 아가미 조직에 대한 조직학적 변화와 수컷의 성적 행동이 감소한다는 결과를 보고하였다(Hued et al., 2012). Langiano and Martinez (2008)는 열대어류 Prochilodus lineatus에서 glyphosate에 대한 단기 독성 및 생화학적, 생리학적, 조직학적 연구를 수행한 바 있다. 한편 우리나라에서 두 번째로 사용량이 많은 비선택성 제초제 Basta에 대한 어류의 독성 연구는 marine medaka Oryzias dancena를 대상으로 조직학적 변화 연구만이 보고되고 있다(Kang et al., 2014). 미꾸리속(genus Misgurnus) 어류는 우리나라에서 식량과 불교의식에 중요한 어종으로(Kim et al., 1994) 내수면 어업 생산량은 약 831톤이며, 부족한 수요를 충당하기 위해 중국으로부터 매년 10,000톤 정도를 수입에 의존하고 있다(수산정보포털, 2018). 미꾸리속 어류는 동아시아에 광범위하게 분포하는 잉어목 담수어류이며, 중국에서는 식용과 전통 중의학에서 상업적으로 중요한 종이다. 중국대륙에서 미꾸리과 어류의 양식 생산량은 2010년에는 204,552톤에 이른다. 진흙 바닥에 잔잔하거나 부드럽게 흐르는 강, 호수, 연못에서 발견된다. 이들 어종은 넓은 농경지와 논과 평야배수로에 많이 분포한다(Kano et al., 2010; Qin et al., 2010). 특히 미꾸라지는 빠른 배아발달, 짧은 세대기간, 많은 수의 난을 가지고 있어 형질전환 연구에 잠재적 모델 시스템으로 주목받고 있으며, 염색체 조작, 유전자 이식 등 실험모델로 이용되고 있다(Nam et al., 2003). 논은 미꾸리속 어류의 산란장소로 이용되며 산란 후 자치어의 성장 및 번식장소로서 매우 중요한 역할을 한다(Naruse and Oishi, 1996; Tanaka, 1999). 우리나라에서 벼농사를 위해 제초제를 처리하는 시기는 주로 4월말부터 6월 중순까지로 이 시기는 미꾸라지의 산란기와 일치하여 논과 하천에 서식하는 미꾸라지에게 치명적 악영향을 끼친다. 송사리의 생육단계별로 농약 등의 화학물질에 대한 어류의 감수성 변화를 조사한 결과, 발육 초기단계에는 감수성이 매우 민감한 것으로 조사되었다(신 등, 1987). 차세대 염기서열 분석기술을 이용한 RNA sequencing (RNA-seq)이 최초로 보고된 이후(Nagalakshmi et al., 2008; Wilhelm, et al., 2008), 실험 과정과 대용량 정보의 확보 및 분석에 대한 빠른 진보를 가져왔다(Marguerat and Bähler, 2010; Martin and Wang, 2011; Ozsolak and Milos, 2011). De novo assembly는 transcriptome reconstruction을 위해 reference genome을 요구하지 않으므로 게놈 분석이 완료되지 않은 종의 연구에 유리하다(Grabherr et al., 2013). 또한 RNA sequencing은 주로 실험조건에 따른 유전자 발현을 비교하는데 사용하고 있으며, 각 실험조건에 따라 up 또는 down regulation된 차등 발현 유전자(DEG, differentially expressed genes)를 reads count를 통해 쉽게 분석 가능하다(Wang et al., 2009; Anders and Huber, 2010). 최근 위와 같은 장점으로 인해 농약 처리에 따른 전사체 프로파일링에 대한 연구가 진행되고 있다. 제초제 Atrazine에 대한 zebrafish의 전사체 분석(Weber et al., 2013), 연어의 피부에 기생하는 물이를 구제하기 위한 살충제 Deltamethrin 처리에 따른 물이(louse)의 전사체 프로파일링(Chávez-Mardones and Gallardo-Escárate, 2015), glyphosate와 Roundup에 노출된 brown trout의 산화스트레스 유도에 대한 전사체 프로파일링 등의 연구가 진행된 바 있다(Webster and Santos, 2015). 본 연구에서는 사용량이 많음에도 불구하고 다양한 연구가 이루어지지 않은 비선택성 제초제인 glufosinate ammonium을 원료로 하는 Basta에 대해 논과 하천 생태계의 중요한 생물 종인 미꾸라지를 대상으로 독성 평가와 유전자 발현 연구에 대한 유용한 가이드라인을 제공하기 위해 수행하였다. 이를 위해 첫째, 미꾸라지 성장단계별 Basta의 급성독성을 펑가하기 위해 반수치사 농도를 구하였으며, 둘째, Basta의 아만성 독성 평가를 위해 조직학적 변화를 관찰하였으며, 마지막으로 Basta 노출에 따른 다양한 조직별 차등 발현하는 전사체 프로파일을 분석하였다.