PUKYONG

형질전환 생산효율 극대화를 위한 세포 배양과 유전체 조작 메커니즘 개선 및 공정 설계 연구

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Abstract
For the production of bio-fuel, many researches have been actively conducted on discovering and improving the excellent microalgae species capable of high-speed growth and high lipid content. In many cases, exogenous materials delivery is highly dependent on the cell cycle status and growth curve. Commonly, The highest expression following electroporation is obtained when cells are in mid-log phase growth. That’s why cell wall is weak in mid-log phase. So, In this phase, It facilitates maximum exogenous DNA uptake. However, It takes many time to prepare cells in mid-log phase. So, It is good to find ways to reduce time of cell preparation. The way to reduce time of cell preparation is to increase initial concentration. So, It is possible to save time of cell preparation and obtain higher exogenous materials delivery efficiency.
And for more than a decade, conventional benchtop EP systems using cuvette type unit cell has been widely used. However, current conventional EP systems require high equipment cost because of using high voltage and it is suffered from side effects due to an electrochemical reaction, local pH variations, Joule heating, and gas bubble formation near electrodes. Recently, a unique digital microfluidic EP system based on droplet contact charging phenomenon was suggested as an alternative solution. The productivity achieved by the proposed digital microfluidic EP system was comparable to that of conventional benchtop EP system but it is still insufficient in some biological experiments. Here, we demonstrated a high throughput EP system capable of dealing with billions of cells more effectively for more efficient transformation research. So this paper can be useful for biological researcher to do electroporation.
Author(s)
김영훈
Issued Date
2018
Awarded Date
2018.2
Type
Dissertation
Publisher
부경대학교
URI
https://repository.pknu.ac.kr:8443/handle/2021.oak/14252
http://pknu.dcollection.net/common/orgView/200000010798
Affiliation
부경대학교 대학원
Department
대학원 화학공학과
Advisor
임도진
Table Of Contents
목차 i
List of Figures v
Abstract ⅹ
1. 서론 1
2. 이론 6
2.1 형질전환 6
2.2 유전자 편집기술 6
2.3 분광 광도계 7
2.4 전기천공법 8
2.5 유세포 분석기 8
2.6 공초점 현미경 9
2.7 미세조류 9
2.8 Chlamydomonas reinhardtii 10
3. 실험방법 11
3.1 디지털 전기천공법을 이용한 미세조류의 형질전환 11
3.1.1 디지털 전기천공 시스템 개략도 11
3.1.2 세포 및 DNA 준비 13
3.1.3 분광광도계를 이용한 세포 수 확인 15
3.1.4 디지털 전기천공 실험 방법 17
3.2 연속적인 디지털 전기천공법을 이용한 형질전환체 생산성 확보 18
3.2.1 연속적인 디지털 전기천공 시스템 개략도 18
3.2.2 연속적인 디지털 전기천공 시스템의 작동 원리 20
3.2.3 연속적인 디지털 전기천공 실험 방법 22
3.3 액적 접촉충전 시스템을 활용한 유전자 편집기술의 접목 23
3.3.1 액적 접촉충전 시스템 개략도 23
3.4 유세포분석기 및 공초점현미경을 이용한 형질전환율 분석 25
4. 결과 및 고찰 26
4.1 디지털 전기천공법을 이용한 미세조류의 형질전환 26
4.1.1 Yo-Pro-1의 농도 결정 26
4.1.2 세포 성장 곡선과 Yo-Pro-1 전달 효율 분석 28
4.1.3 초기 세포 농도의 조절 33
4.1.4 빛의 조절에 따른 조건 38
4.1.5 CFP 일시적인 유전자 발현에 대한 빛 조건에 따른 효과 41
4.1.6 디지털 전기천공법 최적화를 위한 생물학 조건에 따른 효과 44
4.1.7 디지털 전기천공법 최적화를 위한 전기적조건에 따른 효과 49
4.1.8 디지털 전기천공최적화조건에 따른 Yo-Pro-1 전달효율 분석 52
4.1.9 디지털 전기천공의 최적화조건에 따른 CFP 일시적인 유전자 발현 효율 분석 55
4.2 연속적인 디지털전기천공법을 이용한 형질전환체의 생산성확보 58
4.2.1 연속적인 디지털 전기천공법의 유체 흐름에 대한 수치해석 58
4.2.2 연속적인 디지털 전기천공법의 인가되는 전압 및 유속에 따른 Yo-Pro-1 전달 효율 분석 60
4.2.3 병렬전극쌍을 활용한 연속적인 디지털 전기천공법 고안결과 64
4.3 액적 접촉충전 시스템을 활용한 유전자 편집기술의 접목 66
4.3.1 Bouncing EP를 활용한 유전자 편집기술 CRISPR/Cas9 66
4.3.2 형광 단백질의 세포 내 전달 68
4.3.3 CRISPR/Cas9 기술을 세포핵내 전달하기 위한 Bouncing EP 70
5. 결론 72
6. 참고문헌 74
Degree
Master
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산업대학원 > 응용화학공학과
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