형질전환 형광관상 유리메기(Kryptopterus vitreolus) 생산을 위한 기초 연구

Abstract

유리메기는 복강을 제외한 모든 부위가 투명하고 관상어로서 널리 유통되고 있어, 본 종을 이용하여 형질전환 형광 관상어로 개발할 경우 그 가치가 높을 것으로 예상된다. 이에 본 연구는 유리메기를 형질전환 어류로 개발하기 위한 기초 연구로서, 마취, 유전자의 direct injection 및 성 성숙 유도 등을 연구하였다. 그 결과, 어류에의 스트레스를 최소화하기 위한 최적 마취제로 염산리도카인과 중탄산나트륨을 혼합 사용하였을 시 가장 마취효과가 높은 것으로 나타났고, 그 최적 농도로는 염산리도카인 200ppm과 중탄산나트륨 100ppm 으로 확인되었다. 확립된 마취조건 하에서 어류의 등 근육에 유전자의 direct injection을 실시하고 그 발현 양상을 관찰한 결과, 본 연구에 사용된 CMV 및 바다송사리 β-actin 프로모터 모두에서 형광유전자가 발현됨이 관찰되었고, 발현강도는 GFP 유전자를 제외한 CFP와 RFP는 비슷한 강도를 보였다. 또한 화이트니그로 프로모터보다 바다송사리 프로모터가 더 잘 발현하는 것으로 확인되어, 가장 발현이 강한 유전자는 바다송사리의 mlc2 CFP인 것으로 나타났다. 형질전환 어류를 생산하는데 기본적인 조건으로서 수정란의 대량 확보를 위해 본 종의 산란을 위한 성숙을 유도한 결과, 사용된 성숙 유도 호르몬 중에서 잉어뇌하수체 호르몬의 4mg/g 농도가 hCG나 LHRH-α보다 효과가 높은 것으로 나타났다. 잉어뇌하수체 호르몬을 어류에 복강 주사하고 조직학적 분석을 수행한 결과, 난황포기의 난소가 관찰되고 난소의 크기가 커진 것을 확인할 수 있었고 정소의 경우에는 개체 당 1mg/g의 농도만으로도 완전한 성 성숙을 유도하여 방정이 가능함을 확인할 수 있었다. 그러나 온도를 낮추어 처리하거나 호르몬의 복합처리 등을 시도한 결과, 성숙호르몬을 이용한 성 성숙 유도만으로는 최종 성숙과 산란까지 유도할 수 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 종의 수정란 대량 확보를 위한 산란을 유도하기 위하여 앞으로 빛, 수온 및 기타 환경 조건을 조절하는 등의 후속 연구가 필요하다고 판단된다.

The objective of this study is to establish a basis for producing transgenic fluorescent ornamental fish by using the glass catfish (Kryptopterus vitreolus). The glass catfish is a freshwater fish belonging to the family Siluridae. It is transparent, apart from the abdominal cavity, and it has been widely distributed as an ornamental fish since the 1930s. In this study, the anesthetic effect on glass catfish of MS-222 (Tricaine methanesulfonate), clove oil, 2-phenoxyethanol, NaHCO3, lidocaine-HCl and lidocaine-HCl/NaHCO3 was investigated. Based on the induction and recovery time, 200/100ppm of lidocaine-HCl/NaHCO3 was considered to be an effective agent. To analyze the effects on the maturation inhibition of the gonads from the anesthetics, carp pituitary was injected to the fish via intraperitoneal injection with 200/100ppm of lidocaine-HCl/NaHCO3 as an anesthetic agent. A histological analysis of the gonads showed that the gonadotropin action of the carp pituitary was normally observed in all injected fish. Therefore, 200/100 ppm of lidocaine-HCl/NaHCO3 proved to be an efficient anesthetic agent for induced breeding in this fish species. An intramuscular injection of DNA containing various promoters (CMV pDs, CMV pAM, pod β-actin, pod mlc2, pAN β-actin) was also administered to the fish to investigate the expression activity of various promoters and several fluorescent genes. The fluorescence activity of experimental groups was increased gradually from 10 days after postinjection with 80㎍ of DNA per fish. This activity persisted in the muscles for as long as 30 days postinjection. The expression of injected DNA was found predominantly within muscle cells along the injection path and in scattered muscle cells anterior to the injection site. Glass catfish were also injected with carp pituitary (CP), hCG (human chorionic gonadotropin), and LHRH-α (Luteinizing hormone-releasing hormone analog) by using various dosages in order to induce sexual maturation. CP was proven to be more effective than hCG or LHRH-α. In the case of females, ovary maturity was successfully derived at 4mg/g of CP, but final maturation and spawning were not successfully induced. However, the males in all of the CP-treated group were shown to have fully matured and ejaculate testes.