미토콘드리아 DNA에 근거한 두족류 종 판별을 위한 초고속 PCR 분석법의 개발 및 검증

Abstract

In this study, single PCR, real time PCR and Ultra-Fast PCR were examined for identification of six types of Cephalopod (Two skin Webfoot octopus, One skin Webfoot octopus, Long arm octopus, Octopus vulgaris, Japanese common squid, Loligo chinensis) purchased from markets. To design the species-specific PCR primers difference the nucleotide sequence of the mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (COI) genes of Two skin Webfoot octopus, One skin Webfoot octopus, Long arm octopus, Octopus vulgaris, Japanese common squid and Loligo chinensis was analyzed for the identification of each species registered in the GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) and has been analyzed. In order to obtain the size variation of amplified fragments through Ultra-Fast PCR, I designed COI (Am_COI_2-1), COI (Af_COI_2-1), COI (Om_COI_2), COI (Tp_COI_3), 16S rRNA (Octopus vulgaris), 16S rRNA (Loligo chinensis) primers for each species. The optimal PCR conditions and primers were selected for six types of Cephalopod to determine target base sequence in its PCR products. In the case of ordinary PCR, Two skin Webfoot octopus was only amplified by COI (Am_COI_2-1), One skin Webfoot octopus was only amplified by COI (Af_COI_2-1), Long arm octopus was only amplified by COI (Om_COI_2), Japanese common squid was only amplified by COI (Tp_COI_3), Octopus vulgaris was only amplified by 16s rRNA (Ov) and Loligo chinensis was only amplified by 16s rRNA (Lc) primer. As a result, 85, 100, 97, 135, 81 and 168 bp of specific PCR products were confirmed for each major material such as Two skin Webfoot octopus, One skin Webfoot octopus, Long arm octopus, Japanese common squid, Octopus vulgaris and Loligo chinensis respectively. The method using species specific primers developed in this study can be easily performed on distinguishing 6 types of Cephalopod and it takes in less than 30 minutes. I developed diagnostic PCR primer sets for the Ultra-fast PCR to discriminate 6 different Cephalopod that can run an analysis within 30 minutes and this system is very prompt and precise that it can be applied to not only the living organism but also marine products. Thus, I determined that this analysis method can be utilized for the food safety management and protection of consumer's right.

본 연구에서는 미토콘드리아 DNA 염기서열의 Cytochrome C oxidase I (COI) 유전자 분석법을 통하여 두족류에 해당하는 Two skin 주꾸미, One skin 주꾸미, 돌문어, 낙지, 살오징어, 한치꼴뚜기 품종의 외투 조직에서 추출된 게놈 DNA 중에서 실시간 고속 PCR 반응에 의해 상기 전술한 특정 염기서열 지역의 DNA만을 신속하고, 정확하게 증폭하며, 그 증폭량을 정량적으로 측정할 수 있어, Two skin 주꾸미, One skin 주꾸미, 낙지, 돌문어, 살오징어, 한치꼴뚜기 6 품종을 확실하게 구분할 수 있다. PCR 반응은 94℃에서 5 분간 초기변성 후, 94℃ 30 초 변성, 62℃ 30초 결합 및 72℃ 30초 신장을 총 35회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5 분간 최종 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 Single PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 EtBr로 염색하여 이미지분석기에서 각 품종의 유전자 증폭산물을 확인하였으며, Two skin 주꾸미, One skin 주꾸미, 낙지, 돌문어, 살오징어, 한치꼴뚜기 품종에 대한 PCR 산물들을 유전자 클로닝한 후, 품종 간의 염기서열을 비교 분석한 결과, Two skin 주꾸미는 85 bp, One skin 주꾸미는 100 bp, 낙지는 97 bp, 돌문어는 81 bp, 살오징어는 135 bp 한치꼴뚜기는 169 bp 크기의 DNA 단편이 관찰되었다. 실시간 고속 유전자증폭 반응은 UF-150 GeneChecker Ultra-Fast PCR system (Gene System, Korea)을 이용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 95℃ 30초 반응 후 95℃ 5초, 62℃ 5초, 72℃ 10초의 3단계로 PCR을 50 사이클 수행하였다. 결론적으로, 두족류의 생물학적 시료로부터 간단한 방법으로 Ultra-fast PCR을 수행하기 위한 DNA를 확보하여 시료 준비 시간을 단축 시킬 수 있고, 정성 분석이 모두 가능하며, 상대적 정량 분석이 가능할 것으로 사료되며, 선발된 각 종 특이 프라이머 세트를 이용한 Two skin 주꾸미, One skin 주꾸미, 낙지, 돌문어, 살오징어, 한치꼴뚜기 품종의 판별이 30분내에 가능한 시스템을 개발하여 빠르고 안전하고 정확하게 수행될 수 있어서 생물 생태뿐만 아니라 수산물 가공식품에 대해서도 이를 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.