유도된 전복, Haliotis discus hannai 3배체의 생식소 발달 및 성 성숙 특징

Abstract

Reproductive characteristics of triploid abalone, Haliotis discus hannai induced by caffeine treatment to fertilized eggs. Cytogenetic analysis indicated that the induced tridploids would possess the 1.5-fold higher chromosomal constitute relative to diploids as evidenced by metaphase counting (3n = 54 vs. 2n = 36) and flow cytometry (1.5 times of cellular DNA content compared to that of diploid). This polyploidy status was consistent with all the presumed triploid individuals irrespective of their ages and genders . External gonadal morphology of diploid and triploid abalones was compared. Diploid females possessed cone-shaped appendage and well-developed greenish ovaries at spawning season. However, same-aged triploid siblings showed only apparently depressed and small-sized gonads, suggesting no significant gametogenic activity. Diploid males displayed cream-white colored testes but triploid males exhibited only brown-yellow colored gonad. Gonad hepatopancreas somatic index (GHSI) of triploid abalone was smaller than that of diploid counterpart. Based on the histological examinations, diploid abalones had matured oocytes and spermatozoa, but most of triploid abalones displayed underdeveloped and delayed gonad developments in both sexes. In general, triploid females showed only early stage of gonad development containing only a few irregular oocytes, and triploid males represented some spermatocytes and/or spermatids in their testes. However, for both triploid females and males, there were large variations in gonad developments among individuals. In a preliminary spawning trial using 2-year-old triploid and diploid males , all the diploid males were able to release sperm successfully, whereas triploids failed. mRNAexpression levels of selected genes, which would be potentially related with gonad development, were examined in triploid and didploid gonads based on the RT-qPCR assay. FOXL2, VTG, PC1, CDA, 5-HT genes were highly expressed in diploid females while VEZP 30 gene was highly expressed in triploid females. TEKT3-2, TSSK1 genes were highly expressed in diploid males while SOX9, cGMP, TATS, SL highly expressed in triploid males.

인공 산란을 유도하여 인공 수정을 실시했으며 수정란에 화학적 처리(caffeine)을 수행하여 제1극체 방출을 억제함으로써 3배체를 유도 하였다. 유도한 3배체의 세포 유전학적 특징 분석으로 Flow cytometry 분석과 염색체 수 및 핵형 분석을 통하여 확인하였다. Flow cytometry 분석을 통하여 DNA함량이 3배체가 2배체에 비해 1.46배 차이가 나타나 2배체와 3배체 구별을 확인 할 수 있었으며 염색체 수 및 핵형 분석을 통하여 2배체의 염색체 수는 2N=36으로 나타났고, 3배체 염색체 수는 3N=54으로 나타나 3배체는 2배체에 비해 1.5배의 염색체 수를 나타내어 2년째까지 배수성이 안정적으로 유지되었음을 확인하였다. 2년 산 2배체와 3배체의 생식소 외형을 비교 분석한 결과 2배체 암, 수 모두 생식소가 부풀어 올라 육안으로 암, 수 생식소 색상이 구별이 되었으나 3배체의 경우 생식소가 2배체에 비해 덜 부풀어 오르며 생식소 색상이 변화가 크게 없는 걸 육안으로 학인 할 수 있었다. 또한 2배체와 3배체 개체들의 성숙도 분포를 살펴보면 2배체는 대부분 암, 수 구분이 되거나 초기 성숙 단계(stage 2), 산란이 가능한 성숙 단계(stage 3)의 개체들이 있었으며 3배체의 경우 암, 수 구분이 가능한 단계(stage 1)의 개체들이 대부분인 걸로 보아 3배체 암컷, 수컷 모두에서 생식소 발달 억제 및 지연이 되는 것으로 관찰 되었다. 2배체와 3배체의 간췌장-생식소 숙도 지수를 분석한 결과 2배체가 3배체 보다 높은 값을 나타내는 걸 보였으며 특히 암컷의 경우 수컷보다 큰 차이를 나타내었고 통계적으로 유의한 간췌장-생식소 숙도 지수의 차이를 나타내었다. 조직학적으로 살펴 본 결과 1년 산 2배체 전복의 경우 암컷은 초기 난모 세포 및 일부 성숙 중인 난모 세포들도 관찰 되었으며 3배체의 암컷의 경우 정확이 난소가 보이지 않아 암컷으로 구분하기 어려웠으며 미성숙한 단계로 보였다. 1년 산 2배체의 경우 생식소 내강에 정모 세포와 정세포가 발달 밀집되어 있었으며 일부 변태되는 정자도 관찰이 되었으며 3배체 수컷의 경우 생식소 내강 내에 정세포와 정모 세포 세포들이 관찰이 되었다. 2배체의 암컷의 경우 성숙 하여 성숙한 난들이 난소 소낭을 채우고 있었으며 3배체의 암컷의 경우 대부분 생식소 활성화가 이루어지지 않은 상태를 보였으며 몇 개체는 초기 난모세포가 관찰되는 개체도 있었으며 특이적으로 한 개체는 성숙 중인 난모 세포가 관찰이 되었다. 2배체의 수컷의 경우 성숙 하여 정소 소낭 내에 변태를 마친 정자들로 가득 차 있었으며 3배체의 수컷의 경우 정모 세포와 정세포들이 관찰 되었다. 또한 육안으로 성숙한 2배체와 3배체 개체들을 각각 10미 씩 선발하여 인공 방정을 유도한 결과 2배체의 경우 모두 방정을 한 반면 3배체의 경우 모두 방정을 하지 않았다. 2배체와 3배체의 차등 발현을 비교 분석을 위해 real-time RT-PCR을 수행 한 결과 암컷의 경우 FOXL 2, VIT, PC1, CDA, 5-HT는 2배체 난소에서 높은 발현 경향을 보였으나 VEZP 30의 경우 3배체 난소에서 높은 발현의 경향을 보였으며 수컷의 경우 TEKT3-2, TSSK1에서 2배체 정소에서 발현이 높은 경향을 나타냈으며 SOX9, cGMP, TATS, SL 에서는 3배체 정소에서 발현이 2배체 정소에서 발현보다 높은 경향을 보였다.