Protective mechanisms of Pyropia yezoensis protein on dexamethasone-induced muscle atrophy

Abstract

노화와 질병에 의해 나타나는 생리학적 변화는 매우 다양하며 그 중 가장 보편적인 신체변화는 골격 근육량의 감소로 인한 근위축증 이다. 근위축증은 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으키고 사망의 위험성도 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 방사무늬 김 (Pyropia yezoensis)에서 분리한 단백질 (PYCP)과 그로부터 합성한 펩타이드 (PYP15)의 근위축 억제효과를 규명하고자 하였다. 먼저, PYCP가 마우스유래 골격근 세포(C2C12)의 근위축 억제 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 합성 글루코코르티코이드인 덱사메타손을 자극제로 이용한 모델을 사용하였다. MTS assay 결과, PYCP에 의해 세포 생존율이 유의적으로 증가하였고 덱사메타손으로 유도된 세포독성을 효과적으로 억제하였다. 그리고 근육 손상 마커인 creatine kinase (CK)와 lactate dehydrogenase (LDH)의 농도의존적인 생성감소를 확인하였다. 또한, 덱사메타손으로 유도된 myotube diameter와 근원성 조절인자인 myogenin 발현의 감소가 PYCP에 의해 효과적으로 억제되었다. 근육에서 단백질 분해경로를 활성화시키는 전사인자인 forkhead box O (FoxO) 1 과 3a의 전사활성 및 핵으로의 이동은 PYCP에 의하여 억제되었으며, 그 결과 FoxO1과 FoxO3a에 의해 매개되어지는 단백질 분해경로인 ubiquitin-proteasome과 autophagy-lysosome 경로를 조절하는 atrogin-1/muscle atrophy F-box (MAFbx), muscle RING finger-1 (MuRF1), cathepsin-L 그리고 LC3-I/II의 발현을 억제하였다. 이러한 결과로부터 PYCP는 전사인자 FoxO의 조절을 통하여 단백질 분해를 억제함으로써 PYCP의 항 근위축 메커니즘을 나타냄을 확인하였다. In vitro 실험에서의 결과를 토대로 in vivo 모델에 적용하여 그 효과를 검증하기 위해 덱사메타손으로 자극된 C57BL/6 마우스 모델을 사용하여 근위축에 대한 PYCP의 치료효과 및 관련된 메커니즘을 확인하였다. PYCP 식이는 덱사메타손에 의한 근위축 유도 마우스에서 체중, 종아리 두께 그리고 근육 무게의 감소를 약화시켰으며, 혈중 glucose, CK와 LDH의 생성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 이러한 덱사메타손에 의한 PYCP의 근위축 보호효과는 단백질 합성에 관여하는 경로인 insulin-like growth factor-I (IGF-I) 매게 protein kinase B (Akt)/rapamycin-sensitive mTOR complex I (mTORC1) 경로의 활성화와 단백질 분해에 관여하는 전사인자인 FoxO와 이에 의해 조절되는 cellular proteolytic system의 억제를 통해 조절되어짐을 real-time PCR 및 western blot analysis를 통해 확인하였다. 덱사메타손에 의해 억제된 insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR), insulin-receptor substrate-1 (IRS-1), Akt 그리고 mammalian target of rapamycin (mTOR)의 인산화는 PYCP에 의해 증가되었다. mTOR은 여러 단백질과 상호작용하여 mTORC1과 rapamycin-sensitive mTOR complex II (mTORC2) 두 개의 별개의 복합체를 형성하는 세린-트레오닌 키나아제로 덱사메타손에 의한 근위축은 mTORC1에 의해 유도되어진다. mTORC1은 mTOR, GβL 그리고 Raptor로 이루어져 있는 mTOR complex로서 덱사메타손에 의해 억제된 Raptor의 발현은 PYCP에 의해 활성화되었다. mTORC1의 downstream인 p70 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K), ribosomal protein (S6) 그리고 4E-binding protein 1 (4E-BP1)의 인산화와 eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E)의 발현 역시 PYCP에 의해 증가되었다. 또한 근위축의 활성에 관여하는 대표적인 전사인자인 FoxO의 변화를 관찰한 결과, 덱사메타손으로 유도된 FoxO1와 FoxO3a의 전사활성 및 핵으로의 이동은 PYCP에 의하여 억제되었으며 FoxO 전사인자로 매개되어지는 ubiquitin-proteasome과 autophagy-lysosome 관련 단백질 분해 신호가 PYCP에 의해 억제됨을 확인하였다. 또한, 덱사메타손의 자극은 근육단백질인 액틴과 마이오신을 고정하는 단백질을 분해시켜 근육단백질의 분해를 활성화하는 calpain-1과 calpain-2의 발현을 증가시키고 calpain 억제 단백질인 calpastatin의 발현을 감소시켰으나 PYCP를 동시처리 함으로서 농도 유의적으로 억제되는 것을 확인 하였다. 이러한 결과로부터 PYCP는 단백질 합성경로를 활성화하고 단백질 분해경로를 억제함으로써 덱사메타손에 의한 근육의 위축을 보호함을 확인하였다. 앞선 PYCP에서의 실험결과들을 바탕으로, PYP15를 이용하여 근위축 보호효과와 그 메커니즘을 덱사메타손으로 자극된 C2C12 myotubes를 통해 확인하였다. MTS assay 결과, PYP15에 의해 세포 생존율이 유의적으로 증가하였고 덱사메타손으로 유도된 세포독성을 효과적으로 억제하였다. 또한, 덱사메타손에 의한 CK와 LDH의 증가, myotube diameter와 myogenin 발현의 감소 그리고 노화 바이오마커인 senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)의 증가를 억제함으로서 PYP15가 근위축 보호 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 덱사메타손에 의한 PYP15의 근위축 보호효과는 단백질 합성에 관여하는 IGF-I 매게 Akt/mTORC1 경로의 활성화와 단백질 분해에 관여하는 FoxO 전사인자와 이에 의해 조절되는 cellular proteolytic system의 억제를 통해 조절되어짐을 real-time PCR 및 western blot analysis를 통해 확인하였다. 덱사메타손의 자극은 세포 내 IGF-IR, IRS-1, Akt 그리고 mTOR의 인산화를 억제하였으나 PYP15를 동시처리 함으로서 증가되었다. 덱사메타손에 의한 근위축은 mTORC1에 의해 조절되어 지는데 덱사메타손에 의해 감소된 Raptor와 그 downstream인 p70S6K, S6 그리고 4E-BP1의 인산화와 eIF4E의 발현은 PYP15를 동시처리 함으로서 증가되었다. 또한, 덱사메타손으로 유도된 FoxO1 및 FoxO3a의 전사활성과 핵으로의 이동은 PYP15의 동시처리에 의해 감소되었으며 FoxO1 및 FoxO3a의 전사활성에 의해 매개되어지는 ubiquitin E3 ligase인 atrogin-1/MAFbx와 MuRF1, autophagy-lysosome system인 cathepsin-L과 autophagy-related proteins 그리고 20S proteasome의 증가된 활성이 PYP15를 동시처리 함으로서 감소됨을 확인하였다. 또한, 덱사메타손의 자극은 근육단백질인 액틴과 마이오신을 고정하는 단백질을 분해시켜 근육단백질의 분해를 활성화하는 calpain-1과 calpain-2의 발현을 증가시키고 calpain 억제 단백질인 calpastatin의 발현을 감소시켰으나 PYP15를 동시처리 함으로서 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PYP15가 근육단백질의 합성을 촉진하고 단백질 분해를 억제함으로써 근위축의 잠재적인 치료제 또는 건강기능성 식품 소재로 활용될 수 있음을 시사한다.