바다송사리 (Oryzias dancena) 배아줄기세포 유사세포의 개발과 특성분석

Abstract

배아줄기세포는 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화가 가능하며, 자가 재생이 가능하다는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징들을 통해 배아줄기세포는 재생 의학분야, 유전자 이식 연구 혹은 기초 과학을 연구하는데 있어서 유용한 모델로 주목 받아 왔고, 어류 배아줄기세포 역시 형질전환 어류의 생산이나 질병 치료에 관한 연구 모델 그리고 종 보존과 관련된 연구에서 활용될 수 있다. 이 논문에서는 위와 같은 이점을 활용하기 위하여 바다송사리(Oryzias dancena)로부터 배아줄기세포를 확립하는 실험을 실시하였으며, 확립되어진 세포주를 이용하여 기본적인 세포 특성 분석과 배아줄기세포의 활성을 조사하였다. 본 연구에서는 O. dancena의 배아를 사용하여, 총 41 번의 초기배양을 통해 2 개(4.9%)의 세포주를 확립하였으며, 각 세포주의 배가시간은 29.84 시간과 28.59 시간 이었고, 9%와 6%의 clonogenicity를 나타내었다. 각 세포주의 염색체 정상성은 45.0%와 46.7%로 나타났으며, 세포의 분열에 있어서 중요한 영향을 주리라 생각되는 4 가지의 배지성분인 fetal bovine serum, fish serum, basic fibroblast growth factor, embryo extract를 배지에서 제거하거나 혹은 첨가하는 농도를 조절하여, 세포의 분열속도 차이를 비교해 보았다. 그 결과 각 경우에서 두 세포주 모두 성장의 변화를 확인할 수 있었고, 이를 통해서 4 가지 성분이 세포 성장에 중요한 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 한 개 세포주의 clonal growth를 통해 5 개의 subline을 분리, 배양하였고 alkaline phosphatase (AP) 활성, 전능성 유전자의 발현 그리고 체외에서의 분화 잠재성 등을 확인해 보았다. 다섯 개의 sublines는 32.5, 20.0, 22.5, 25.0 그리고 35.0%의 염색체 정상성을 보였으며, 19, 15, 10, 2 그리고 25%의 clonogenicity를 확인할 수 있었다. 또한, 각 sublines에서 형성된 콜로니는 33, 21, 20, 11 그리고 38%의 비율로 AP 활성을 가지는 것으로 조사되었다. 전능성 유전자인 Oct4, Nanog, Klf4, Sall4, Zfp281a의 발현이 조사되었고, 그 결과, Sall4 유전자에 대한 한 개 subline을 제외한 모든 sublines에서 Klf4, Sall4, Zfp281a 유전자의 발현이 나타나는데 반해 Oct4와 Nanog 유전자의 발현은 모든 sublines에서 나타나지 않았다. 또한, 체외 분화 유도를 위해 embryoid body를 형성시켜 부착시켰을 때, 신경 계통 세포 및 상피세포 유사 세포로 분화하는 것을 확인하였고, 이를 통해 확립된 세포주가 분화 능력을 가지고 있다는 것 역시 알 수 있었다. 본 연구로부터, 두 개의 O. dancena 배아세포주가 확립되었으며, 조사된 한 개의 세포주는 배아줄기세포 유사세포인 것으로 확인되었다. 이 세포주는 고품질 형질전환 어류 생산, 클론 생산 연구, 발달 및 분화에 대한 연구, 그리고 세포 기반의 생물 자원 보전을 위한 유용한 재료로 사용될 수 있을 것이다.

Embryonic stem (ES) cells are specific cell type that have two major properties. First, they can differentiate into all cell types comprising body. Second, they are able to self-renew consistently. Accordingly, they have already received attention as one of good materials for regenerative medicine, transgenic research and basic sciences. Fish ES cells can be utilized to produce transgenic animals, research the diseases as a model study, and preserve bio-resources at cellular level. For these reasons, I, in this study, tried to establish ES cell lines from marine medaka (Oryzias dancena) and subsequently characterized the established cell lines on basic cellular characteristics and ES cell activities. As the results, I established two O. dancena embryonic cell lines from 41 primary cultures employing blastula embryos (2/41=4.9%). Doubling time of each established cell line was 29.84 h and 28.59 h, respectively, and clonogenicity of each was 9% and 6%. A proportion of cell population bearing the normal chromosome number was 45.0% and 46.7% in cell line-1 and –2, respectively. Additionally, I tried to check growth response of cell lines depending on main medium components including fetal bovine serum, fish serum, basic fibroblast growth factor, and embryo extract. Removal or reduced concentration of each supplement from the medium resulted in significant growth inhibition in both cell lines indicating that four factors are important for the growth of established cell lines. Next, I isolated five sub-cell lines through clonal growth of cell line-1 in order to identify ES cell activities including alkaline phophatase (AP) activity, pluripotent gene expression, and differentiation potential in vitro in established cell line. Five sublines showed 32.5, 20.0, 22.5, 25.0 and 35.0% chromosome normality and 19, 15, 10, 2 and 25% clonogenicity, respectively. In addition, 33, 21, 20, 11 and 38% of colonies formed from each cell line showed AP acitivity. When the expression of five pluripotency genes including Oct4, Nanog, Klf4, Sall4 and Zfp281a was investigated in five sublines, the expression of Klf4, Sall4 and Zfp281a genes was identified in all five sublines except for one line in Sall4, while Oct4 and Nanog gene expression was not detected in any one of them. All five sublines were able to form embryoid bodies and differentiate spontaneously into neuronal lineage cells and epidermal-like cells in vitro. Consequently, two O. dancena embryonic cell lines were established from this study and one cell line examined showed ES cell-like activities. These cell lines can be utilized as a useful material for the production of high-quality transgenic fish, reproductive cloning research, study of developmental process, and preservation of cell-based bio-resources.