Biocontrol of bacterial fruit blotch with a novel bacteriophage ACPWH infecting Acidovorax citrulli

Abstract

Acidovorax citrulli은 그람음성 간균이며, 박과(Cucurbitacea)에 종자 전염병의 일종인 과일썩음병(Bacterial fruit blotch, BFB)을 유발하여 경제적인 피해를 입히는 것으로 알려져 있다. 이 세균은 유전적으로 2 개의 주요 그룹으로 나눠지며, 그룹 I은 수박을 제외한 대부분의 박과 식물에 감염을 일으키고, 그룹 II는 주로 수박에 질병을 일으킨다. A. citrulli 는 주로 II형, III형, IV유형 분비체계 및 편모를 이용하여 감염을 일으키는 것으로 보고되어 있다. A. citrulli의 BFB 유발에 의한 경제적인 중요성에도 불구하고, 현재 사용되고 있는 구리 기반의 항생제, 종자의 가열이나 직접적인 화학물질 처리 등의 세균 제어 방법들은 처리에 제한이 있을뿐더러 병원성을 완전히 근절할 수 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 A. citrulli로 인해 유발되는 BFB를 제어하기 위한 새로운 방법의 필요성이 대두되고 있다. 개발 중인 많은 기술 중, 세균을 죽일 수 있는 능력을 가진 바이러스인 박테리오파지를 이용한 세균성 질병 억제 방법의 경우 대체 제어 방법으로 매우 적합하므로, 병원성 세균을 박테리오파지를 이용하여 조절하는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 본 연구에서는 A. citrulli에 감염하는 박테리오파지를 분리하고 특성을 확인한 다음 분리된 박테리오파지를 사용하여 BFB을 제어하는 것을 연구 목표로 하였다. 그 결과, 100개 이상의 박테리오파지를 분리하였고 숙주 범위가 넓은 2 종류의 파지를 선별하고 특성을 확인하였다. 박테리오파지 ACPWH 및 ACP17은 각각 Siphoviridae과 및 Myoviridae과에 속하는 파지로 확인되었다. 박테리오파지 ACPWH을 수박 종자에 코팅하여 A. citrulli 감염 조건 하에서 발아를 유도한 후 식물의 생존율을 확인하였을 때, ACPWH를 코팅 처리하지 않은 대조군이 전혀 생존하지 못한 것과 달리, 발아 및 생존율은 90% 이상을 나타내어 ACPWH의 A. citrulli에 대한 보호 효과를 증명하였다. 또한, 종자의 발아 과정 중의 보호 효과 뿐만 아니라, A. citrulli를 접종한 수박과 멜론에서도 BFB 증상을 제어 하는 것을 알 수 있었다. 추가적으로, ACPWH를 토양에 처리할 경우 수박의 잎으로 전이 할 수 있음을 확인하였다. 수박의 잎에 A. citrulli을 분무 접종하고 증상이 나타난 후 ACPWH을 토양에 첨가하면 8시간 후에 수박의 잎에서 ACPWH가 PCR로 검출되었고, DAPI로 ACPWH를 염색하여 관찰했을 경우 염색된 ACPWH가 24시간 후에 잎의 끝에 축적되는 것을 확인하였다. ACPWH을 처리한 수박은 처리하지 않은 대조군이 80%의 발병률을 보이는 것에 비해 27%의 발병률을 보여 ACPWH가 BFB을 제어하는 데 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 증명하였다. 생물학적 방제 기술로서의 박테리오파지 개발은 여러 제한 요소가 있으며, 그 중 박테리오파지 내성균의 발생이 주요 문제로 여겨지고 있다. 따라서 추가적인 연구를 통하여 A. citrulli가 파지 내성을 가질 경우에서의 파지 내성과 병원성과의 관계를 조사하였다. A. citrulli에 transposon 변이 실험법을 사용하여 만들어낸 3,264종의 A. citrulli 돌연변이 중 spot assay와 plague assay를 통해 분리한 AC-17-G1으로 명명된 돌연변이의 경우, 종자에 코팅하였을 때 수박에 병원성을 가지지 않는 것을 확인하였다. 이 내성균은 Cupin 단백질 유전자의 가운데 Tn5가 포함되어 있음을 확인하였고, 해당 유전자의 야생형 유전자에 의한 상보적 보완에 의하여 복구 시켰을 때 병원성을 회복하였다. 또한, CRISPR/Cas9를 이용하여 야생형에서 Cupin 단백질 유전자의 일부분을 제거하였을 때 병원성과 파지 내성을 다시 상실하는 것을 확인하여 Cupin 단백질 유전자가 병원성과 파지 내성의 원인 유전자임을 증명하였다. 일반 배지에서의 AC-17-G1의 성장은 야생형보다 느렸지만, D-만노오스 6-인산염 또는 D-과당 6-인산염을 배지에 첨가하면 성장 속도가 정상적으로 돌아오는 것을 확인하였다. 또한, 돌연변이균에서 추출된 LPS의 크기는 SDS 분석으로 확인하였을 때 야생형에서의 LPS 크기보다 작음을 확인하였다. 이러한 모든 결과를 종합하였을 때, Cupin 단백질이 LPS 합성에 관여하는 만노오스인산 이성질화효소이며, LPS가 A. citrulli 의 병원성과 파지 감수성의 중요한 요소임을 증명할 수 있다.

Acidovorax citrulli is a gram-negative bacterium causing an economically important seed borne disease in Cucurbitaceae family known as bacterial fruit blotch (BFB). This bacterium is a road shaped bacterium and genetically divided into two major groups, group I strains that are aggressive on most of cucurbits except watermelon and group II which are mainly causing disease on watermelon. It is reported that A. citrulli cause infection mainly through Type II, III and IV secretion system in addition to bacterium flagellum. Despite of the importance of this bacterium, control methods against the bacterium are considerably limited. Use of copper-based antibiotics, heating and seed treatment methods were not able to completely eradicate this disease. Therefore, new methods to control this disease are highly necessary. Bacteriophages, the viruses of bacteria, with ability of killing bacteria are highly suitable as an alternative control method. Phages are most entity on the planet with specific host range. Use of phages to control pathogenic bacteria in plants has been tried and phage isolation against A. citrulli was initiated in this study. We aim to isolate and characterize bacteriophages infecting A. citrulli and to use these isolated bacteriophages to control BFB. As result, we isolated over 100 bacteriophages and two phages with wide host range were identified and characterized. Bacteriophage ACPWH and ACP17 were among firstly isolated phages belonging to Siphoviridae and Myovciridae family, respectively. Initiative results of seed coating with bacteriophage ACPWH showed up to 90% of germination and complete survival of the watermelon plants compared to 100% death of non-treated control. In addition to the protection of plants during seed germination, bacteriophage ACPWH can control BFB symptoms in both watermelon and melon plants inoculated with A. citrulli. Furthermore, bacteriophage ACPWH could be translocated from soil to the leaves of melon plants. When leaves of melon plants were spray-inoculated with A. citrulli and bacteriophage ACPWH was added to soil after symptoms had developed, ACPWH was detected by PCR in foliar tissue 8 h after addition to soil. DAPI-stained ACPWH accumulated at the leaf tip after 24 h. Melon treated with ACPWH showed 27% disease severity compared to 80% for the non-treated control, indicating that ACPWH can be used to control BFB. Development of phage biocontrol may considerably be facing multiple limitations and the occurrence of bacteriophage-resistant bacteria is the major issue. Therefore, we aim to investigate possible phage resistance of A. citrulli and relationship between phage resistance and pathogenicity. Phage resistant mutant named as AC-17-G1 was isolated among 3,264 A. citrulli mutants produced by transposon mutation system using spot assay and plaque assay, which was confirmed as avirulent in seed coating method. The mutant has the integrated Tn5 in the middle of Cupin protein gene. This mutant recovered its pathogenicity by complementation with corresponding wild type gene. Furthermore, site directed mutation of this gene from wild type by CRISPR/Cas9 system resulted in the loss of pathogenicity and phage resistance, which showed that the Cupin protein gene is the responsible gene for the pathogenicity and phage resistant. The growth of AC-17-G1 in normal medium was much less than the wild type but the growth turned into normal when D-mannose 6-phosphate or D-fructose 6-phosphate was added to the medium, which indicated that the Cupin protein functions as a phosphomannos isomerase. SDS analysis of LPS extracted from the mutant was smaller than that from wild type. All these data suggest that the Cupin protein is a phosphomannos isomerase involved in LPS synthesis and LPS is important determinant of pathogenicity and phage susceptibility of A. citrulli.